Contribution à la compréhension du mécanisme de formation de dextranes ou gluco-oligosaccharides ramifiés en  alpha-1,2  par l
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Contribution à la compréhension du mécanisme de formation de dextranes ou gluco-oligosaccharides ramifiés en alpha-1,2 par l'enzyme GBD-CD2 : études cinétique et structurale, Contribution to the understanding of the alpha-(1→2) branching mechanism of dextrans and gluco-oligosaccharides by GBD-CD2 enzyme : kinetic and structural studies

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Description

Sous la direction de Pierre Monsan
Thèse soutenue le 20 septembre 2010: INSA de Toulouse
Issue de la troncature de la dextrane-saccharase DSR-E, l’alpha-(1→2) transglucosidase recombinante GBD-CD2 catalyse à partir de saccharose le branchement de molécules acceptrices tels que les dextranes, les isomalto-oligosaccharides ou les gluco-oligosaccharides (GOS ; [6)-alpha-D-Glcp-(1→]n-alpha-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp, avec 1-Dextrane-saccharase
-Alpha-(1→2) glucosylation
-Structure 3D
-DSR-E
-GBD-CD2
-Dextrane
-Gluco-oligosaccharide
-Transglucosidase
GBD-CD2 is a recombinant alpha-(1→2) transglucosidase constructed by truncation of the DSR-E dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299. From sucrose, GBD-CD2 catalyses the alpha-(1→2) branching reaction onto acceptor molecules such as dextrans, isomalto-oligosaccharides or gluco-oligosaccharides (GOS; [6)-alpha-D-Glcp-(1→]n-alpha-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp, 1Source: http://www.theses.fr/2010ISAT0035/document

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Nombre de lectures 91
Poids de l'ouvrage 15 Mo

Exrait

a
a
En vue de l’obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l’Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse
Discipline ou spécialité : Ingénieries microbienne et enzymatique
PPrréésseennttééee e ett s soouutteennuuee pparar YYoaoannnn B BRRIISOSONN
Présentée et soutenue par Yoann BRISON
Le 20 septembre 2010
JURY Titre :
Titre :
CONTRIBUTION À LA COMPRÉHENSION DU MÉCANISME DE FORMATION DE
CONTRIBUTION À LA COMPRÉHENSION DU MÉCANISME DE FORMATION DE
DEXTRANES OU GLUCO-OLIGOSACCHARIDES RAMIFIÉS EN -(1→2) PAR
DEXTRANES OU GLUCO-OLIGOSACCHARIDES RAMIFIÉS EN -(1→2) PAR
L’ENZYME GBD-CD2 : ÉTUDES CINÉTIQUE ET STRUCTURALE
L’ENZYME GBD-CD2 : ÉTUDES CINÉTIQUE ET STRUCTURALE


JURY
M. Richard HASER Directeur de Recherches CNRS, IBCP, Lyon Rapporteur
M. Charles TELLIER Professeur, Université de Nantes Rapporteur
M. Bauke W. DIJKSTRA Professeur, Université de Groningen, Pays-Bas Examinateur
M. Samuel TRANIER Maître de Conférences, Université Paul Sabatier, Examinateur
Toulouse
Mme Magali REMAUD-SIMEON Professeur, INSA Toulouse Présidente
M. Pierre MONSAN Professeur, INSA Toulouse Directeur de thèse

École doctorale : Sciences Écologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries de Toulouse
Unité de recherche : Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés
UMR5504 CNRS/INSA, UMR792 INRA/INSA
Collaborations avec le laboratoire « Protein Crystallography Group » de l’Université de Groningen aux
Pays-Bas et avec le laboratoire de Biophysique Structurale de l’IPBS à Toulouse
Directeur de Thèse : Pierre MONSAN
Rapporteurs : Richard HASER, Charles TELLIER




a
En vue de l’obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l’Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse
Discipline ou spécialité : Ingénieries microbienne et enzymatique
Présentée et soutenue par Yoann BRISON
Le 20 septembre 2010
Titre :

CONTRIBUTION À LA COMPRÉHENSION DU MÉCANISME DE FORMATION DE
DEXTRANES OU GLUCO-OLIGOSACCHARIDES RAMIFIÉS EN -(1→2) PAR
L’ENZYME GBD-CD2 : ÉTUDES CINÉTIQUE ET STRUCTURALE

JURY
M. Richard HASER Directeur de Recherches CNRS, IBCP, Lyon Rapporteur
M. Charles TELLIER Professeur, Université de Nantes Rapporteur
M. Bauke W. DIJKSTRA Professeur, Université de Groningen, Pays-Bas Examinateur
M. Samuel TRANIER Maître de Conférences, Université Paul Sabatier, Examinateur
Toulouse
Mme Magali REMAUD-SIMEON Professeur, INSA Toulouse Présidente
M. Pierre MONSAN Professeur, INSA Toulouse Directeur de thèse

École doctorale : Sciences Écologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries de Toulouse
Unité de recherche : Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés
UMR5504 CNRS/INSA, UMR792 INRA/INSA
Collaborations avec le laboratoire « Protein Crystallography Group » de l’Université de Groningen aux
Pays-Bas et avec le laboratoire de Biophysique Structurale de l’IPBS à Toulouse
Directeur de Thèse : Pierre MONSAN

Rapporteurs : Richard HASER, Charles TELLIER






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Nom : BRISON Prénom : Yoann

Titre : Contribution à la compréhension du mécanisme de formation de dextranes ou gluco-
oligosaccharides ramifiés en -(1→ 2) par l’enzyme GBD-CD2 : études cinétique et structurale.

Filière : Ingénieries microbienne et enzymatique
Directeur de thèse : Pr. Pierre MONSAN
Année : 2010 (20 Septembre) Lieu : Toulouse N° ordre : 1044 Pages : 251

RÉSUMÉ :
Issue de la troncature de la dextrane-saccharase DSR-E, l’-(1→ 2) transglucosidase recombinante
GBD-CD2 catalyse à partir de saccharose le branchement de molécules acceptrices tels que les
dextranes, les isomalto-oligosaccharides ou les gluco-oligosaccharides (GOS ; [6)--D-Glc p-(1→] -n
-D-Glc p-(1→4)-D-Glcp, avec 1<n<9). L’objet de cette étude a porté sur la compréhension des
relations structure-activité de GBD-CD2 afin d’investiguer les facteurs structuraux responsables de la
synthèse des liaisons osidiques de type -(1→ 2). La troncature rationnelle du domaine de liaison au
glucane (GBD) de l’enzyme GBD-CD2 (192 kDa) a abouti à l’isolement de trois formes tronquées
actives, de masses moléculaires égales à 180, 147 et 123 kDa. Après purification de GBD-CD2 et de
N -GBD-CD2 (123 kDa), des études cinétiques ont permis de mettre en évidence que les enzymes 123
présentent la même régiospécificité. L’activité d’hydrolyse du saccharose peut être modélisée par le
-1
modèle de Michaelis – Menten (k respectifs de 109 et 76 s ). En présence de dextrane accepteur, cat
ces enzymes sont activées. L’activité d’-(1→ 2) glucosylation suit un modèle Ping Pong Bi Bi (k cat
-1
respectifs de 970 et 947 s ). En modulant le ratio molaire entre le donneur d’unités glucosyle et
l’accepteur de ces unités ([saccharose]/[dextrane]), il est possible de synthétiser des dextranes dont le
pourcentage de liaisons -(1→ 2) est contrôlé et varie de 10% à 40%. La caractérisation des produits
de la réaction menée en présence de saccharose et de GOS a permis d’isoler et de caractériser pour la
première fois des GOS arborant des unités glucosyle branchées en -(1→ 2) sur les unités glucosyle
adjacentes de la chaîne principale. Enfin, la résolution de la structure de N -GBD-CD2 à 3,2 Å 123
révèle que cette enzyme adopte le repliement original « en U » similaire à celui décrit pour GTF180-
N. La comparaison des gorges catalytiques des deux dextrane-saccharases cristallisées apporte des
éléments pouvant expliquer la régiospécificité singulière de N -GBD-CD2, et ouvre la voie à des 123
travaux de mutagenèse visant à investiguer le rôle de résidus potentiellement clés.

MOTS-CLÉS :
Dextrane-saccharase, -(1→ 2) glucosylation, DSR-E, dextranes branchés en -(1→ 2), GOS
branchés en -(1→ 2), purification, structures.

JURY :
Mme Magali REMAUD-SIMÉON, Professeur, INSA Toulouse, Présidente de Jury
M. Richard HASER, Directeur de Recherche CNRS, IBCP, Lyon, Rapporteur
M. Charles TELLIER, Professeur, Université de Nantes, Rapporteur
M. Bauke W. DIJKSTRA, Professeur, Université de Groningen, Pays-Bas,
M. Samuel TRANIER, Maîtres de Conférences, IPBS, Toulouse,
M. Pierre MONSAN, Professeur, INSA Toulouse, Directeur de Thèse


Soutenance prévue le 20 Septembre 2010 à l’Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse
École doctorale : SEVAB (Sciences Écologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries)
Laboratoire : Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés UMR5504, UMR792.




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Last name: BRISON First name: Yoann

Title: Contribution to the understanding of the -(1→ 2) branching mechanism of dextrans and
gluco-oligosaccharides by GBD-CD2 enzyme: kinetic and structural studies.

Specialty: Enzymatic and microbial engineering
Supervisor: Pr. Pierre MONSAN
th
Year: 2010 (September 20 ) Place: Toulouse Pages: 251

Abstract:
GBD-CD2 is a recombinant -(1→ 2) transglucosidase constructed by truncation of the DSR-E
dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299. From sucrose, GBD-CD2 catalyses
the -(1→2) branching reaction onto acceptor molecules such as dextrans, isomalto-oligosaccharides
or gluco-oligosaccharides (GOS; [6)--D-Glc p-(1→] --D-Glc p-(1→4)-D-Glcp, 1<n<9). This work n
has been focused on structure activity relationship studies. Rational truncations of the glucan binding
domain (GBD) led to the expression in E. coli of three active enzymes, showing molecular masses of
180, 147 and 123 kDa. After purification of the recombinant GBD-CD2 and N -GBD-CD2, we 123
showed that both enzymes display the same regiospecificity. Steady-state kinetics revealed that the
-1 -1
activity of sucrose hydrolysis displays a Michaelis Menten type of kinetics (k 109 s and 76 s , cat
respectively). In the presence of dextran acceptor, these enzymes are activated. The -(1→2)
transglucosidase activity from sucrose onto dextrans was modelled by a Ping Pong Bi Bi mechanism
-1 -1
(k 970 s and 947 s , respectively). When varying the molar ratio between the glucosyl donor and cat
the acceptor ([sucrose]/[dextran]), the percentage of -(1→ 2) linkages in dextrans can be controlled
from 10% to 40%. Additionally, from reactions in the presence of GOS and sucrose, we isolated and
characterized new -(1→ 2) branched GOS with contiguous -(1→ 2) branchings along linear GOS
chains. Finally, the X-ray structure of N -GBD-CD2 at 3.2 Å resolution revealed that this enzyme 123
has a very original “U folding” similar to that described for GTF180- N. Study of the residues lining
the catalytic gorges of the two crystallized enzymes revealed the structural determinants possibly
involved in the singular regiospecificity of N -GBD-CD2. Our work opens the way to 123
mutagenesis work for discovering key structural determinants of N -GBD-CD2. 123

Keywords:
Dextransucrase, -(1→2) glucosylation, DSR-E, -(1→ 2) branched dextrans, -(1→ 2) branched
GOS, purification, structures.

JURY :
Mrs Magali REMAUD-SIMÉON, Professor, INSA Toulouse, France
Mr Richard HASER, Research Scientist CNRS, IBCP, Lyon, France
Mr Charles TELLIER, Professor, University of Nantes, France
Mr Bauke W. DIJKSTRA, Professor, University of Groningen, The Netherlands
Mr Samuel TRANIER, Lecturer, IPBS, Toulouse, France
Mr Pierre MONSAN, Professor, INSA Toulouse, France


th
PhD Defense planned September, the 20 2010 at the National Institute of Applied Sciences in
Toulouse
Doctorate School: SEVAB (Ecological, Veterinary and Agronomic Sciences and Bioengineering)
Laboratory: Laboratory for Biosystems and Chemical Engineering UMR5504 CNRS/INSA,
UMR792 INRA/INSA