Crystallisation and structure solution of the c-ring of F_1tnoF_1tn1 ATP synthase from spinach chloroplasts [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Melanie Vollmar

Melanie Vollmar

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• Publié le: 01 janvier 2009
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Extrait

Crystallisation and Structure Solution
of the c-Ring of FF ATP Synthaseo 1
from Spinach Chloroplasts
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
vorgelegt von
Melanie Vollmar
aus Kapsweyer
Juli 2009Aus dem Institut für biochemische Pflanzenphysiologie
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Gedruckt mit der Genehmigung
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Referent: Prof. Dr. G. Groth
Koreferent: Prof. Dr. L. Schmitt
Tag der mündlichen Prüfung: 17.09.2009Meiner MutterSummary
ATP synthase from spinach belongs to a group of essential enzymes which produce most of the
cell's ATP supply. The energy stored in light is used in photosynthetic active complexes t o produce
an outward pointing electron/proton gradient across the thylakoid membrane of chloroplast s. This
energisation of the membrane is a prerequisite for actiFve AFTP synthase. ATP synthase pumps o 1
protons back across the thylakoid membrane into the chloroplast. During this translocation process,
the electrical energy of the gradient is transformed into the mechanical energy of a rot ation. This
rotation takes place in the membrane part F and is translated via a stalk into a membrane ass ociatedo
part F which carries the catalytic active sites. Conformational changes in these binding si tes result1
in formation of an anhydride bond between the substrates, ADP and inorganic phosphate, and
produces ATP. For F a detailed structure is available and also the reaction mechani sm in the1
binding sites is known on the atomic level. In contrast, for a Flittle information is availabl e, ando
mechanisms as well as structural details are still at the levels of proposals and hypothese s. In this
work X-ray crystallography was used to solve the structure for the main part of F , namely th eo
proton translocating rotor, to a resolution of 3.8 Å. This is the first structure of c-ritheng of a proton
pumping ATP synthase and can therefore be used to explain several findings of binding beha viour
as well as proposed structural details and mechanism. Crystals produced with new crystallisati on
conditions had no effect on the resolution. Instead, some of the changes improved the spot quality in
diffraction experiments and decreased the mosaicity. Co-crystallisation cof-ri tnghe w ith t he
inhibitors DCCD (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), phloretin, and phloridzin was also atte mpted.
For DCCD detailed biochemical information about inhibitory effects is already known. H owever, a
structure of the c-ring of a proton translocating ATP synthase with covalently bound DCCD has not
yet been solved. Phloridzin is a sugar derivative of phloretin. For both substances inhibi tory effects
have been reported but only a little biochemical information is available and no bi nding site is
identified. Data set analysis of a protein-inhibitor crystal with phloridzin showed extra electron
density near one proton binding site, but couldn't be identified for definite because of low res olution
of 4.25 Å.Zusammenfassung
Die ATP Synthase aus Spinat gehört zu einer Gruppe von essentiellen Proteinen, die den größten
Teil an ATP in einer Zelle produzieren. Die in Licht gespeicherte Energie wird von den
photosynthetisch aktiven Komplexen genutzt, um einen nach außen gerichteten
Elektronen-/Protonengradienten über die Thylakoidmembran der Chloroplasten aufzubauen. Diese
Energetisierung der Membran ist die Voraussetzung für eine aktive FF ATP Synthase. Diese pum pto 1
im Gegenzug die Protonen in den Chloroplasten. Während dieses Transportprozesses, wi rd die
elektrische Energie des Gradienten in die mechanische Energie einer Rotation übersetzt. Diese
Rotation findet im Membranteil stFatt, und wird über einen Stab in den membranassozier ten Teilo
F weiter gegeben, der die katalytisch aktiven Bindungstaschen trägt. Konformationsänderungen in1
diesen Bindungstaschen resultiert in der Ausbildung einer Anhydridbindung zwischen den
Substraten ADP und anorganischem Phosphat, um ATP zu produzieren. Für F ist bereits eine1
detaillierte Struktur bekannt, und sowohl Reaktionsmechanismus als auch der Aufbau der
Bindungstaschen sind auf atomarer Ebene gelöst. Die Methode der Röntgenkristallanalyse wurde i n
dieser Arbeit genutzt, um die Struktur des Hauptbestandteil,s devonn Fprotonentransportierende no
Rotor aus Untereinheict , aufzuklären. Dies gelang mit einer Auflösung von 3.8Å. In dieser Arbe it
wird die erste detaillierte Struktur des rotierenden Rings einer protonentransloziere nden ATP
Synthase vorgestellt. Diese Struktur kann genutzt werden, um Ergebnisse zu Bindungsverhal ten
sowie vorgeschlagene Strukturdetails und Mechanismen zu erklären. Mit Änderungen in den
Kristallisationsbedingungen, an die Kristallisation anschließende Manipulationen und allgem eine
Verbesserungen in der Reinigung wurde versucht die Auflösung zu verbessern und eine
detailliertere Struktur zu erhalten. Kristalle, die unter neuen Bedingungen gewachsen waren zeigten
leider keine Verbesserung in der Auflösung, hatten aber hingegen schärfere Reflexprofi le in
Beugungsexperimenten und eine niedrigere Mosaizität. In einem weiteren Projekt, sollt e der
Membranteil zusammen mit den Inhibitoren DCCD (N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid), Phl oretin und
Phloridzin kristallisiert werden. Für DCCD gibt es bereits detaillierte biochemis che Informationen,
aber noch keine Struktur in kovalent gebundener Form am c-Ring einer Protonen ATP Synthase.
Phloridzin ist ein Zuckerderivat von Phloretin. Für beide Substanzen werden inhibitor ische Effekte
berichtet. Es sind aber nur wenige biochemische Informationen vorhanden und eine Bindungstasche
ist nicht bekannt. In einem Datensatz mit einem Co-Kristall aus Phloridzicn-Ri und ngde konntme
zusätzlich positive Elektronendichte an einer Protonenbindungstasche identifiziert werden. Eine
Zuordnung zu Phloridzin war aber wegen der geringen Auflösung von 4.25 Å nicht möglich.Content
Content
Abbreviat..............................................................................................................................ions 1 .....
1.Introduction ............................................................................................................................... 2 ....
1.1.ATP Synthases................................................................................................................ 2 .......
1.2.Structure of ATP Synthase from Spinach Chloroplast ...................................... 3 ....................
1.2.1.Structure of CF ................................................................................................ 4 .............1
1.2.2.Structure of CF 5 .............o
1.3.Functional Mechanisms in F and F............................................................................... 8 ......o 1
1.3.1.Catalytic Mechanism within CF ................................................................................ 8 ...1
1.3.2.Energetics and Mechanics of CF ............................................................................. 9 .....o
1.4.Membrane Intrinsic F Domain 11 ............o
1.4.1.Subunit c.......................................................................................................... 11 ............
1.4.2.Subunit a..................................................................................................................... 14 .
1.4.3.The a/c Interface ..................................................................................................... 16 .....
1.4.4.Rotor Movement Induced at the a/c Interface ..................................................... 17 ........
2.Purpose of this Study................................................................................................. 20 .................
3.Materials and Methods ............................................................................................................... 21 .
3.1.Material...........................................................................................................................s 21 ...
3.1.1.Biological Material...............................................................................s 21 .....................
3.1.2.Technical Equipment...................................................................................... 21 .............
3.1.3.Chemica..................................................................................................ls 22 ..................
3.1.4.Consumables................................................................................... 23 ............................
3.1.5.Materials for Crystallisation............................................................................. 23 ...........
3.2.Isolation and Purification of CF F from Spinach Chloroplasts .....................23....................o 1
3.2.1.Isolation of Thylakoid Membrane..................................................s 23 ...........................
3.2.2.Solubilisation of CFF.................................................................................. 24 ..............o 1
3.2.3.Fractionated Ammonium Sulphate Precipit