Development of a competitive immunoassay microarray for the detection of the Staphylococcus aureus enterotoxins A-D and H in dairy products [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Simone S. Moises

Simone Selva

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• Publié par: universitat_regensburg
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 33
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

Development of a Competitive Immunoassay
Microarray for the Detection of the
Staphylococcus Aureus Enterotoxins A-D and H in
Dairy Products

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

an der naturwissenschaftlichen Fakultät IV
- Chemie und Pharmazie –
der Universität Regensburg


vorgelegt von
Dipl. Chem. Simone S. Moises
aus Essenbach
im September 2010 DANKSAGUNG

Diese Arbeit entstand zwischen Juli 2007 und September 2010 am Institut für Analytische
Chemie, Chemo- und Biosensorik der Universität Regensburg.

Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. Otto Wolfbeis
für die Bereitstellung des komplexen und sehr interessanten Themas, die fördernden und
konstruktiven Diskussionen und Anregungen hinsichtlich meiner Arbeit, die Bereitstellung
des speziellen Geräteequipments und die Ermöglichung der Auslandsaufenthalte zum
Gedankenaustausch und der Verbesserung der Produktionsabläufe.

Herrn PD Dr. Michael Schäferling danke ich für die fachliche Betreuung des Microarrayteils
meiner Arbeit.

Der Surface Plasmon Resonance-Teil meiner Arbeit entstand in Zusammenarbeit mit Dr.
Thomas Hirsch. Vielen Dank für die stets konstruktive und produktive Anleitung, die
hilfreiche Gesprächen und die Betreuung von Christoph Fenzl, der im Rahmen seiner
Bachelorarbeit zu diesem Teil meiner Arbeit beigetragen hat. Desweiteren danke ich allen
Mitgliedern des Institutes die zum Gelingen der Arbeit beigetragen haben.

Mein Dank gilt auch Prof. Dr. Martin Wagner und dem Institut für Milchhygiene der
Veterinärmedizinischen Universität Wien für die Einladung, Organisation und Betreuung
meiner beiden längeren Aufenthalte am Institut. Speziell sei hier Dr. Beatrix Steszl genannt,
die mich zu jeder Zeit mit Rat und Tat unterstützt hat und zum Gelingen des praktischen Teils
des Projektes beigetragen hat.

Waltraud Mühlbauer, Martin Kemeter, Daniela Achatz, Dr. Martin Link, Thomas Lang,
Judith Stolwijk und Gisela Hierlmeier möchte ich für ihre Freundschaft, Loyalität, Vertrauen
und Ehrlichkeit danken - Eigenschaften von höchster Wertschätzung.

Mein größter Dank gebührt jedoch meinen Eltern Heinz und Sabine Moises, meinen
Geschwistern Andreas und Christopher und meinen Großeltern Ruth und Egon, die mich zu
jeder Zeit und in jeder Hinsicht unterstützt haben.
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Promotionsgesuch eingereicht am: 30.09.2010


Diese Arbeit wurde angeleitet von Prof. Dr. Otto Wolfbeis.


Kolloquiumstermin: 18.11.2010

Prüfungsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. H. Brunner
Erstgutachter: Prof. Dr. O. S. Wolfbeis
Zweitgutachter: Prof. Dr. J. Wegener
Drittprüfer: Prof. Dr. J. Heilmann















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Table of Contents


1. Introduction ........................................................................................................................................ 8
1.1. Food intoxication .......................... 8
1.2. Protein Microarrays as Rapid Tools in the Food Production Chain .............. 9
1.3. Aim of the Work .......................................................................................................................... 10

2. Background ....................................................................................................................................... 11
2.1. Labeling and Purification of Proteins .......................... 11
2.1.1. Labeling Techniques............. 11
2.1.2. Purification Techniques ....................................................................................................... 14
2.2. Protein Microarray Formats and Technology ............. 16
2.2.1. Arrays with 2-Dimensional Surface ...................................................................................... 19
2.2.2. Arrays with 3-Dimen 22
2.3. SPR Technology and Chip Modification Techniques ................................................................... 23
2.3.1. SPR Technology .................................................................................................................... 24
2.3.2. SPR Chip Modification Techniques ...................... 28
2.3.3. SPR Assay Types ................... 32
2.4. Staphylococcus aureus Enterotoxins........................................................................................... 34
2.4.1. Staphylococcus aureus - General Information ..................................... 35
2.4.2. Staphylococcal Enterotoxins - A characterization ............................... 36
2.4.3. Formation and Prevalence of Enterotoxins in Food ........................................................... 39
2.5. Fluorescence: an Application in Protein Microarrays ................................. 40

3. Microarray Surface Preparation ...................................................................... 42
3.1. Control of Cleaning via Contact Angle ........................ 42
3.2. Control of Silanization via Contact Angle Measurement ............................................................ 43
3.3. Control of Immobilization via Fluorescence Detection ............................... 45


4

4. Labeling Staphylococcus Aureus Enterotoxin Antibody................................................................... 46
4.1. Targets: GST- and Staphylococcus Aureus Enterotoxin (A-D and H) Antibodies ........................ 46
4.2. Dyes: Cy3 and Chromeo 546 ....................................... 46
4.3. Determination of the Appropriate Molar Ratio (MR) ................................................................. 46
4.4. Determination of the Protein Content of Labeled and Purified Dyes......... 48
4.5. Determination of the Optimal Dye-to-Protein Ratio by Condition Variation ............................. 49

5. Competitive Enterotoxin Microarray ............................................................................................... 53
5.1. Primary System: Labeled Primary Antibodies as Detection Elements ........................................ 55
5.1.1. Antigen Layer Tests on Hydrophobic Patterned Slides and Fast Slides 55
5.1.2. Labeled Primary Antibody Layer Tests: The Detection Unit on both Slide Types ............... 59
5.1.3. Competitive Systems Development on Nitrocellulose Slides and Patterned Epoxy Slides . 64
5.2. Alternative System on Patterned Slides: Secondary Antibodies as Detection Elements ........... 74
5.2.1. The Detection Unit: Labeled Secondary Antibody Layer Tests ............................................ 74
5.2.2. Competitive Systems Development: Linear Detection Ranges for Enterotoxins ................ 75
5.2.3. Advanced Secondary Systems ............................................................................................. 76
5.3. Cross-reaction Tests .................................................... 82
5.3.1. Primary Detection System ................................... 82
5.3.2. Secondary Detection System ............................................................................................... 84
5.4. Buffer Tests ................................. 86
5.4.1. Blocking Buffer ..................................................................................... 86
5.4.2. Spotting Buffer ................................ 87
5.5. Primary System: Raw Milk as Sample Application ...................................................................... 88
5.6. Comparison with the miniVIDAS system for Sample Applications ............. 93

6. Surface Plasmon Resonance Experiments including Validation ..................................................... 96
6.1. Toxin Immobilization Control for the used SAM SPR chips ........................ 96
6.2. Determination of K (anti-SEA/SEA) and K (anti-SEB/SEB) .......................... 99 A A
6.3. Determination of Linear Range and LOD for SEA and SEB in UHT Milk .................................... 102



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7. Experimental Part ........................................................................................................................... 105
7.1. Materials and Methods ............. 105
7.1.1. Chemicals, Solvents and Proteins ..................... 105
7.1.2 .Gel Filtration and Affinity Chromatography ...................................................................... 107
7.2. Buffer Preparation .................................................... 107
7.3. Surface Modification for Staphylococcus aureus Enterotoxin Arrays ....... 108
7.3.1. Surface Cleaning ................................................................................ 109
7.3.2. Silanization ......................................................... 109
7.3.3. Toxin Immobilization on the Array Surface ...................................................................... 110
7.3.4. Blocking of Free Silane Binding Sites ................. 111
7.3.5. Target Incubation ........................................................................