Development of novel ligands influencing neurotransmission in the central nervous system [Elektronische Ressource] / von Britta Caroline Sasse

Britta Sasse

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• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 25
• Langue: Deutsch
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Extrait

Development of Novel Ligands Influencing
Neurotransmission in the Central Nervous System


Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften



vorgelegt beim Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main



von
Britta Caroline Sasse
aus Bad Nauheim




Frankfurt am Main (2007)
(D 30)

















vom Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der Johann Wolfgang
Goethe-Universität als Dissertation angenommen.









Dekan: Prof. Dr. H. Schwalbe
1. Gutachter: Prof. Dr. H. Stark
2. Gutachter: Prof. Dr. G. Schneider
Datum der Disputation: 16.04.2007 Danksagung
Für die vorbildliche und engagierte wissenschaftliche Betreuung möchte ich meinem
Doktorvater Professor Dr. Holger Stark danken. Durch seine innovativen Ideen und
vielseitigen Interessen hat Professor Stark es mir ermöglicht, nicht nur einen tieferen
Einblick in mein Forschungsgebiet zu erhalten, sondern darüber hinaus, Kenntnisse und
Weitsicht in multidisziplinäre wissenschaftliche Forschungsgebiete zu bekommen.
Mein Dank gilt Professor Dr. Gisbert Schneider, Herrn Alexander Böcker und Herrn Dr.
Evgeny Byvatov, Institut für Organische Chemie und Chemische Biologie, Johann
Wolfgang-Goethe Universität, Frankfurt am Main, für die effektive Kooperation und enge
wissenschaftliche Zusammenarbeit im Rahmen der Virtuellen Screening Methoden am
Dopamin-D -Rezeptor. Vor allem der Enthusiasmus von Professor Dr. Gisbert Schneider 3
und seine Freude am wissenschaftlichen Arbeiten haben mich sehr geprägt.
Dr. Pierre Sokoloff und seinen Mitarbeitern der Unité de Neurobiologie et Pharmacologie
Moléculaire de I’INSERM in Paris, Frankreich, danke ich für die Einführung in
Radioliganden-Bindungsstudien am Dopamin-D - und -D -Rezeptor und die Bereitstellung 2 3
der humanen Dopamin-D - und -D -Rezeptorzelllinien. Bei Professor Dr. Rob Leurs und 2 3
Professor Dr. Hendrik Timmerman, Free University of Amsterdam, The Netherlands,
bedanke ich mich für das Überlassen der humanen Histamin-H -Rezeptorzelllinie. 1
Professor Dr. John Shine, The Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australia,
danke ich für die Bereitstellung der humanen Dopamin-D -Rezeptorzelllinie. 2
Ich möchte mich bei meinen Kollegen am Institut für Pharmazeutische Chemie für die
Kollegialität und gute Zusammenarbeit bedanken. Vor allem bei Herrn Dr. Jukka
Leppaenen, Herrn Dr. Ulrich Mach und Herrn Oliver Saur möchte ich mich für die
Synthese der in dieser Arbeit untersuchten Testliganden bedanken, sowie Herrn Tim
Kottke für die fruchtbaren pharmakologischen Diskussionen. Frau Carina Richter danke
ich für ihr Engagement im Labor. Vor allem ihre Freude in der Zellkultur hat das
Zellwachstum positiv beeinflusst. Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. Sieglinde Überall
für die wertvolle und freudige Zusammenarbeit im Praktikum „Pharmazeutische Chemie II
- Arzneibuchuntersuchung“, die diese Zeit für mich zu einer schönen Erinnerung werden
lassen. Meinem Kollegen Dr. Matthias Linder, Institut für Pharmakologie, Johann
Wolfgang-Goethe Universität, Frankfurt am Main, danke ich für die zahlreichen
wissenschaftlichen Anregungen, Ratschläge und aufmunternde Unterstützung.
Besonderen Dank gilt meiner Familie und meinen Freunden für ihre andauernde
Motivation und sowie moralischen Beistand. Table of Contents I

1 INTRODUCTION 1
1.1 G Protein-Coupled Receptors 2
1.2 Dopamine 4
1.2.1 Dopamine Receptors 8
1.2.2 Signal Transduction of Dopamine D and D Receptors 12 2 3
1.2.3 Distribution and Function of Dopamine D and D Receptors 14 2 3
1.2.4 Therapeutic Relevance of Selective Dopamine D Receptor Ligands 15 3
1.2.5 Ligand Binding Mode at Dopamine D and D Receptors 22 2 3
1.2.6 Ligands for Dopamine D and D Receptors 23 2 3
1.3 Histamine 27
1.3.1 Histamine H Receptors 29 1
1.3.2 Signal Transduction of Histamine H Receptors1
1.3.3 Distribution and Function of Histamine H Receptors 30 1
1.3.4 Therapeutic Relevance of Histamine H Receptor Ligands 31 1
1.3.5 Ligand Binding Mode at Histamine H Receptors1
1.3.6 Ligands for Histamine H Receptors 32 1
1.4 The Drug Discovery Process 33
1.5 Radioligand Binding Studies 34
2 AIM OF THESIS 36
3 MATERIALS AND METHODS 38
3.1 Materials 39
3.1.1 Reference Substances and Test Compounds 39
3.1.2 Cells, Cell Culture and Protein Assay 40
3.1.3 Chemicals
3.1.4 Buffers and Solutions 41
3.1.5 Radiochemicals and Material for Radioligand Binding Assays 42
3.1.6 Technical Equipment 42
3.2 Methods 43
3.2.1 Cell culture 43
3.2.2 Preparation of Membrane Homogenates 45
3.2.3 Radioligand Binding Studies on Human Dopamine D and D Receptors 46 2S 3
3.2.4 Radioligand Binding Studies on Human Histamine H Receptors 47 1
3.2.5 GTP Shift Competition Binding Experiments 48
3.2.6 Data Analysis and Statistics 49
3.2.7 Virtual Screening Methods 53
4 RESULTS AND DISCUSSION 54
4.1 Assay Validation 55
4.1.1 Saturation Binding Experiments 55
4.1.2 Competition Binding Experiments 59 Table of Contents II

4.1.3 GTP Shift Assay for Discriminating Agonists 63
4.2 Pharmacological Results and Structure-Affinity Relationships 76
4.2.1 Analogues of BP 897 and ST 198 76
4.2.2 Benzhydrylpiperazine Derivatives 83
4.2.3 Pramipexole and Etrabamine Derivatives 94
4.3 Virtual Screening Leading to New Scaffolds 108
4.3.1 Support Vector Machine Based Virtual Screening 108
4.3.2 Lead Identification Strategies for Dopamine D Receptor Ligands 113 3
5 SUMMARY 119
6 ZUSAMMENFASSUNG 122
7 AUSFÜHRLICHE ZUSAMMENFASSUNG 125
8 ABBREVIATIONS 131
9 REFERENCES 135
10 PHARMACOLOGICAL EXPERIMENTAL PROCEDURES 150
10.1 Radioligand Binding Assays 151
10.1.1 Dopamine D and D Receptor Binding Assays 151 2S 3
10.1.2 Preliminary Dopamine D and D Receptor Binding Screening 152 2S 3
10.1.3 Histamine H Receptor Binding Assay 153 1
10.1.4 GTP Shift Assay 154
11 APPENDIX 155
12 CURRICULUM VITAE 169
13 PUBLICATIONS 171 Introduction 1










1 Introduction
Introduction 2

1.1 G Protein-Coupled Receptors
G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest family of cell surface receptors
and share the characteristics of seven transmembrane helices (TM1-7) linked by three
1extracellular loops and three intracellular loops. An additional short helix (H8), directly
2linked to TM7, is located parallel to the cytoplasmic surface of the membrane. It is worth
mentioning, that the bovine rhodopsin GPCR has been the only crystallized structure
2solved. The human genome project has revealed more than 800 GPCR genes, and only
approximately 30 genes are targets of drugs presently on the market, while 50% of all
3,4launched drugs exert their actions on them. Conclusively, GPCRs represent one of the
3,5most important families as pharmaceutical targets in the drug discovery process.
GPCRs communicate extracellular signals into the cell to give an intracellular response.
The nature of the signals is highly diverse and includes extracellular signal molecules, such
as biogenic amines, peptide and protein hormones, nucleosides and nucleotides, sensory
4signals such as light signals and even more (glutamate, ions, eicosanoids). The binding of
these signal ligands to the extracellular site or transmembrane region induces a
conformational change of the receptor which triggers the heterotrimeric guanine nucleotide
1binding proteins, consequently promoting the intracellular response. Generally, activation
of the receptor induces the exchange of guanosine-5’-triphosphate (GTP) for guanosine-5’-
diphoshate (GDP) bound to the G α unit, following the dissociation of the heterotrimeric G
1protein into GTP α and βγ. Both subunits regulate the activity of the effector systems,
1,6,7mainly adenylyl cyclase, phospholipase or ion channels. The production of second
messengers strongly depends on the distinct G protein. The G protein becomes inactivated
1,8 by hydrolysis of the G α bound GTP to GDP.
GPCRs are classified into different families according to their structural and genetic
characteristics: family A (rhodopsin-like), family B (glucagon-receptor-like), and family C
4(metabotropic glutamate receptors). The rhodopsin-like family is by fare the largest
subgroup and is characterized by various highly conserved amino acids and a disulphide
4bridge that connects the first and second extracellular loops. As an example of a
rhodopsin-like GPCR a homology model of the human dopamine D receptor is shown in 3
Figure 1.1.
Among the family A, the subfamily of biogenic amine binding GPCRs is of particular
interest due to its interaction with predominant neurotransmitters such as acetylcholine,
serotonin, histamine, and the catecholamines dopamine, epinephrin