Developmental and functional characterization of cystatin and chitinase of Acanthocheilonema viteae [Elektronische Ressource] / von Smitha Pillai

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• Publié le: 01 janvier 2007
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• Langue: English
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Extrait

Developmental and functional characterization of cystatin and
chitinase of Acanthocheilonema viteae



Dissertation
zur Erlangerung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)



im Fach Biologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Smitha Pillai (M.Sc. Life Sciences)
geboren am 30.01.78 in Bangalore, Indien



Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Dr. Christian Limberg



Gutachter/innen:
Prof. Dr. Richard Lucius
Prof. Dr. Frank Theuring
Prof. Dr. Eva Liebau

Tag der mündlichen Prüfung: 14 Mai 2007


Key words: Acanthocheilonema viteae, Cystatin, Chitinase, Caenorhabditis elegans,
RNAi


















SUMMARY

Nematodes which cause filariasis have detrimental effect on humans.
Strategies to eliminate this disease are based on mass treatment with drugs like
ivermectin. However, they have several drawbacks such as long duration required for
treatment and tenuous financial supports. Understanding the molecular mechanisms
of genes required for parasitism will help to develop novel therapeutic and preventive
strategies.
The aim of this study was a detailed functional characterization of cystatin and
chitinase of Acanthocheilonema viteae, a rodent filarial nematode. To this end, C.
elegans was used as a heterologous system to determine the spatial expression
pattern of A. viteae cystatin and chitinase and thereby their possible functions. The
promoter of cystatin drove the expression of reporter, GFP, to the pharyngeal and
rectal gland cells of transgenic C. elegans lines, this being compatible with the fact
that cystatin is secreted in the parasites. This also suggests that cystatin in A. viteae
is probably required for moulting since generally in C. elegans the enzymes required
for moulting are stored in the pharyngeal gland cells. Moreover, knockdown of
cystatin by RNAi delayed moulting of the infective L3 to the L4. However, the RNAi
effect was transient and the delay in moulting did not affect the viability and infectivity
of the larvae. Analyses of the developmental regulation of cystatin by real-time PCR
showed that it is maximally expressed in the blood microfilarial stage, which are
exposed to the full force of host immune responses. This is compatible to the fact that
A. viteae cystatin immunomodulates the host immune responses.
This study also determined that chitinase of A. viteae plays an essential role in
the moulting of the L3 larvae since knockdown of chitinase inhibited moulting in 90%
of the L3 larvae thereby killing them. Moreover, maximum expression of chitinase
was observed by real-time PCR in the L3 stage supplementing that it is involved in
moulting. RNAi of chitinase in adults led to the release of unhatched microfilariae
confirming the essential catalytic role of chitinase in the degradation of the chitin egg
shells. This study substantiates that cystatin and chitinase of A. viteae are attractive
intervention targets due to their essential endogenous functions in the parasite.


ZUSAMMENFASSUNG

Die Infektion mit Filarien (Nematoden) ruft massive Schädigungen beim Menschen hervor.
Strategien zur Bekämpfung dieser Parasitose basieren auf einer Massenbehandlung mit
Ivermectin und Derivaten. Allerdings ist die Behandlung der Patienten zeitaufwändig und
teuer. In diesem Zusammenhang stellt Aufklärung molekularer Mechanismen, die die
parasitische Lebensform dieser Würmer ermöglichen, einen neuen Ansatzpunkt für die
Entwicklung von Therapeutika und Präventivmaßnahmen dar. Die Moleküle Cystatin und
Chitinase wurden, auf Grund ihrer immunodulatorischen und katalytischen Eigenschaften,
bei der Nager-Filarie Acanthocheilonema viteae als essentielle Proteine identifiziert. Ziel der
vorliegenden Arbeit war daher die detaillierte, funktionale Charakterisierung dieser beiden
Proteine.
Um das räumliche Expressionsmuster und damit potentielle Funktionen des
Sekretionsprotein Cystatins zu ermitteln, wurde der frei lebende Nematode Caenorhabditis
elegans als heterologes Expressionssystem genutzt. Unter dem Einfluss des Cystatin-
Promoters konnte GFP in pharyngealen und rektalen Zellen von C. elegans exprimiert
werden. Möglicherweise ist das Cystatin damit bei A. viteae in den Häutungsprozess
involviert, da bei C. elegans derartige Enzyme in den pharyngealen Zellen gespeichert
werden. Des Weiteren wurde der Häutungsprozess der infektiösen L3 zum Stadium der L4
durch Ausschalten des Gens mittels RNAi um drei Tage verzögert. Allerdings war der Effekt
transient und die Verzögerung des Häutungsprozesses beeinflusste weder die Viabilität noch
die Infektiösität der Larven. Die Analyse der Regulation von Cystatin während der
Entwicklung des Parasiten mittels der Real-Time PCR zeigte, dass das Gen im Stadium der
Mikrofilarien, die der Immunantwort des Wirtes voll exponiert sind, maximal exprimiert wird.
Für die Chitinase von A. viteae konnte eine essentielle Rolle im Häutungsprozess
nachgewiesen werden. Das Ausschalten des Gens führte zu einer Hemmung der Häutung
bei 90 % der L3 und damit zu ihrem Tod. Die maximale Expression im L3 Stadium des
Parasiten ist ein weiterer Hinweis darauf, dass dieses Protein in den Häutungsprozess
involviert ist. Mittels RNAi bei adulten Parasiten konnte die katalytische Rolle der Chitinase
beim Abbau des Chitins im Ei bestätigt werden, da hier nur ungeschlüpfte Mikrofilarien
ausgeschieden wurden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern weitere Hinweise darauf, dass sowohl das Cystatin als
auch die Chitinase von A. viteae auf Grund ihrer essentiellen endogenen Funtionen attraktive
Zielmoleküle in der Bekämpfung von Filariosen darstellen.


Table of contents

1. INTRODUCTION 9
1.1 Filariae 9
1.1.1 Filarial diseases in humans: Epidemiology, clinical manifestations and
treatment 9
1.1.2 The rodent filaria Acanthocheilonema viteae as a proxi model 11
1.2 Target molecules for intervention in A. viteae 13
1.2.1 Cystatin 13
1.2.2 Chitinase 15
1.3 Caenorhabditis elegans as a system to study cystatin and chitinase of
A. viteae 16
1.4 Functional analyses by RNA interference 18
1.4.1 The RNA interference mechanism 19
1.4.2 RNAi in parasitic nematodes 20

2. GOALS OF THIS STUDY 21

3. RESULTS 22
3.1 C. elegans: A heterologous system for promoter studies and expression
of cystatin and chitinase of A. viteae 22
3.1.1 Promoter and genomic sequences of A. viteae cystatin and chitinase 22
3.1.2 Spatial expression of A. viteae cystatin in C. elegans 27
3.1.2.1 Reporter gene activity in worms transiently transfected using particle
Bombardment 27
3.1.2.2 Expression pattern in transgenic worms transformed by microinjection 28
3.1.3 Functionality of A. viteae chitinase gene I promoter in C. elegans 30
3.1.4 C. elegans as a system for expression of A. viteae cystatin 31
3.1.4.1 Transcription of A. viteae cystatin in C. elegans 32
3.1.4.2 Expression and purification of A. viteae cystatin from transgenic C. elegans 34
3.1.4.3 Effect of expression of A. viteae cystatin on C. elegans 35
3.2 Functional characterization of cystatin and chitinase by RNAi 36
3.2.1 Optimal conditions for RNAi in A. viteae 36
3.2.2 Role of cystatin during the developmental cycle of A. viteae 38
3.2.2.1 Knockdown of cystatin at the L3 stage delays moulting to L4 38
3.2.2.2 Quantification of decrease in transcripts at L3 stage after RNAi with

AvCys dsRNA 40
3.2.2.3 Effect on adult worms after knockdown of cystatin at the L3 stages 41
3.2.2.4 RNAi by soaking of adults in AvCys dsRNA 44
3.2.3 Essential role of chitinase during the developmental cycle of A. viteae 44
3.2.3.1 Knockdown of chitinase at the L3 stage inhibits moulting to L4 44
3.2.3.2 Quantification of chitinase transcripts after RNAi at L3 stage 45
3.2.3.3 Knockdown of chitinase in adult A. viteae worms inhibits hatching of
Microfilariae 47
3.2.3.4 Quantification of chitinase transcripts in adult worms treated with RNAi 49
3.3 Developmental expression of cystatin and chitinase in A. viteae 50
3.3.1 Regulation of cystatin during the life cycle of A. viteae 50
3.3.2 Regulation of chitinase during the life cycle of A. viteae 52
3.4 Immunisation studies of A. viteae cystatin in M. unguiculatus 55
3.4.1 Immunisation studies with A. viteae cystatin expressed in E. coli 56
3.4.2 Cystatin as a DNA vaccine 57

4. DISCUSSION 62
4.1 C. elegans as a heterologous s