Differentiation of the endoderm lineage in the murine system [Elektronische Ressource] / Lena Uetzmann

Lena Eyl

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 34
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN
Lehrstuhl für Entwicklungsgenetik
Differentiation of the Endoderm Lineage
In the Murine System
Lena Uetzmann
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung,
Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen
Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. A. Gierl
Prüfer der Dissertation:
1. Univ.-Prof. Dr. W. Wurst
2. Priv.-Doz. Dr. J. Beckers
Die Dissertation wurde am 30.10.08 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die
Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 04.03.09
angenommen.Achte auf Deine Gedanken,
denn sie werden Worte.
Achte auf Deine Worte,
denn sie werden Handlungen.
Achte auf Deine Handlungen,
denn sie werden Gewohnheiten.
Achte auf Deine Gewohnheiten,
denn sie werden Dein Charakter.
Achte auf Deinen Charakter,
denn er wird Dein Schicksal.

aus dem TalmudDanksagung
Mein herzlicher Dank gebührt Dr. Heiko Lickert für die Möglichkeit, meine Promotion als erste Doktorandin in
seiner jungen Arbeitsgruppe durchführen zu können. Die immerwährende positive Einstellung zu seiner Arbeit,
der schier unerschöpfl iche Enthusiasmus und die ausgeprägte Begeisterungsfähigkeit können einem nur ein
Vorbild sein. Vielen Dank für das entgegengebrachte Vertrauen, die Hilfe und Unterstützung, anregende und
unterhaltsame Diskussionen!
Ich möchte Professor Wolfgang Wurst für die Übernahme der Betreuung der Arbeit und PD Dr. habil. Johannes
Beckers für die Teilnahme an der Prüfungskommission für diese Arbeit danken. Zudem gilt mein Dank Professor
Gierl für unkomplizierte und selbstverständliche Übernahme des Vorsitzes der Prüfungskommission.
Mein Dank geht an die gesamte Arbeitsgruppe für die gute Zusammenarbeit über Jahre hinweg und die vielen
gemeinsamen Unternehmungen; dies gilt insbesondere für meine allerersten Kollegen: vielen Dank an Dr. Ingo
Burtscher, Wenke Barkey und Daniela Wagner für die Unterstützung und die gute Zusammenarbeit, für viele
unterhaltsame Stunden und manches Gespräch und Freundschaft, die mir als Norddeutsche das Einleben im
Süden doch sehr erleichtert haben.
Darüber hinaus möchte ich mich bei allen meinen Mitdoktoranden und -doktorandinnen bedanken, die mich
mehr oder weniger lange auf die ein oder andere Weise begleitet haben - ein bißchen Ironie kann einem das
Leben manchmal deutlich erleichtern! Danke für unterstützende Worte, das entgegengebrachte Verständnis und
die wertvollen zwischenmenschlichen Erfahrungen an (nach zeitlichem Erscheinen - „in order of appearance“)
Doris Bengel, Sascha Imhof, Moritz Gegg, Marion Vollmer und Perry Liao. Perry sei an dieser Stelle auch für
etliche gemeinsame Tassen Kaffee und die Korrekturlesearbeiten an dieser Arbeit gedankt! Für ein bißchen
mehr Internationalität in der Arbeitsgruppe, belgische Schokolade und kritische, hilfreiche Kommentare zu
verfaßten Texten geht mein Dank an Dr. Claude van Campenhout, für das gewisse italienische Etwas an Patrizia
Giallonardo.
Vielen Dank auch an Dr. Ursula Gaio für viele sehr nette Abende und vor allem den Einsatz als wandelndes
PubMed...
Meinen zwei äußerst gut laufenden „Kooperationen“, Dr. Susanne Neschen und Dominik Lutter danke ich herzlich
für die gute Zusammenarbeit und die vielen interessanten Einblicke in andere Arbeitsbereiche - würden doch nur
alle Kooperation so gut laufen!
Gute Resultate im Hinblick auf die Mausversuche habe ich auch der Unterstützung der Tierpfl eger zu verdanken
- vielen Dank für das Umsorgen und Mitbeobachten meiner Mäuse!
Viele Freunde und Bekannte haben mein Leben in den letzten dreieinviertel Jahren gekreuzt und mich durch einen
Lebensabschnitt begleitet, der durch unglaublich viele Veränderungen und wichtige Erfahrungen gekennzeichnet
war - sie seien an dieser Stelle nicht unerwähnt, wenn auch nicht alle namentlich aufgeführt.
Ich möchte allerdings an dieser Stelle (stellvertretend) Jennifer Heinke und Philipp Eßer erwähnen, deren
Freundschaft schon weitaus länger währt und der auch die größer gewordene Entfernung nichts anhaben kann!
Es ist schön, wenn man einen Menschen kennt, der einen ohne viele Worte verstehen kann.
Lieber Dominik, auch Dir möchte ich an dieser Stelle danken, vor allem für das Verständnis und die unglaubliche
Ruhe, die Du mir und meiner Arbeit entgegengebracht hast.
„Last but not least“ soll hier der größte Dank an meine Eltern gehen: vielen Dank für die Unterstützung in all
den Jahren, ob nun für geschickte Schokoladen-Notrationen für die „Endphase“ oder wichtige grundlegende
statistische Informationen in einer Geschwindigkeit, die Google in den Schatten stellt. Schön, daß es Menschen
gibt, die immer an mich glauben! Danke!Contents
Contents
1. Abstract 13
2. Introduction 15
2.1. Early embryonic development in the mouse 15
2.2. Formation of the endoderm and the development of the endodermal organs 18
2.3. Important transcription factors during endoderm development: Foxa2 21
2.4. Sox17 22
2.5. Stem cells – a model for embryonic development and an indispensible tool to analyze gene
function 23
2.6. Alterations of the genome 25
2.7.1. MiRNAs in development and differentiation 26
2.7.2. The miRNA pathway: from transcription to target interaction 28
3. Rationale 31
4. Results 33
4.1. Cell lineage tracing - Generation and analysis of Cre mouse lines 34
4.1.1. Targeting of the Sox17 locus 34
a) Design and generation of the targeting vector for the Sox17 locus 34
b) Targeting of ES cells for homologous recombination and deletion of the selection cassette
for the Sox17 locus 35
iCre/+4.1.2. Analysis of the Sox17 mouse line 35
4.1.3. Recombination activity of the Sox17-iCre recombinase at early embryonic stages and after
birth 37
4.1.4. Targeting of the Foxa2 locusFoxa2 locus 37
b) Targeting of ES cells for homologous recombination for the Foxa2 locus 38
iCre/+4.1.5. Analysis of the Foxa2 mouse line 38
4.1.6. Recombination activity of the Foxa2-iCre recombinase at early embryonic stages 38
4.1.7. Recombination activity of the Foxa2-iCre recombinase in embryonic organs 39
iCre4.2. Characterization of the Foxa2 hypomorphic allele 41
iCre Δneo/iCre Δneo4.3. Analysis of the metabolism of Foxa2 mice 44
4.4. Conditional knock-out analysis 46
4.4.1. Characterization of the β-catenin knock-out in the Foxa2-positive cell population:
iCre/+ fl ox/fl ox R/+ Foxa2 ; β-catenin ; R26 mice 46
iCre Δneo/+ fl ox/fl ox R/+4.4.2. Foxa2 ; β-catenin ; R26 mice 47
4.4.3. ß-catenin knock-out in the Foxa2-positive cell population:
iCre/+ fl oxdel/fl ox R/+ Foxa2 ; β-catenin ; R26 mice 48
4.5. Differentiation of ES cells into endoderm 51
4.5.1. Establishment of an in vitro differentiation system from ES cells into endoderm 52
4.5.2. Characterization of the in vitro differentiation system 54
IContents
4.5.3. In vitro differentiation – onset of marker expression (FACS analysis) 54
4.5.4. differentiation – onset of marker expression (live imaging) 55
4.6. Using the in vitro differentiation system to screen for micro RNAs infl uencing endoderm
development 56
4.6.1. Generation of the miRNA expression vector 57
4.6.2. Design of miRNA expression constructs 58
4.6.3. Fluorescent analysis of the miRNA-transgenic ES cell clones using in vitro differentiation and
immunostaining 60
5. Discussion 67
5.1. The generation of iCre mouse lines under the control of two endodermally expressed
transcription factors 67
iCre/+5.2. Sox17 mice – a valuable tool for specifi c deletion of genes in arteries and an indication of
a second promoter activated in the endoderm 68
iCre/+5.3. The Foxa2 mouse line – a new tool to analyze gene function in a variety of tissues 70
iCre5.4. The Foxa2 allele, a hypomorph with interesting potential 72
5.5. Conditional deletion of β-catenin in the domain of Foxa2-iCre recombination activity 74
5.6. Establishment and characterization of an in vitro ES cell assay – steps towards an in vitro
system for embryonic development 76
5.7. Fusion proteins as miRNA-sensors – a tool to test micro RNAs in vitro? 77
6. Material and Methods 83
6.1. Material 83
6.1.1. Equipment 83
6.1.2. Consumables and kits 84
6.1.3. Chemicals 85
6.1.4. Buffers and solutions 87
6.1.5. Enzymes and enzyme kits 89
6.1.6. Antibodies and sera 90
6.1.7. Vectors and BACs 90
6.1.8. Oligonucleotides 90
6.1.9. Probes 92
6.1.10. Molecular weight markers 92
6.1.11. Bacteria and culture media 93
6.1.12. Cell lines, culture media and solutions 93
6.1.13. Mouse lines 94
6.2. Methods
94
6.2.1. Methods in molecular biology
94
6.2.1.1. Preparations of nucleic acids: DNA preparations
94
a) Plasmid and BAC preparations
94
I. Plasmid prepara