Diversité génétique des souches de chlamydophila pecorum : recherche et identification des marqueurs épidémiologiques., Genetic diversity of chlamydophila pecorum strains : research and identification of epidemiological markers

Khalil Yousef Mohamad

Description

Sous la direction de Annie Rodolakis
Thèse soutenue le 12 octobre 2009: Tours
Chlamydophila pecorum est une espèce bactérienne intracellulaire obligatoire de la famille Chlamydiaceae. Le criblage d’une banque génomique de C. pecorum en utilisant un sérum ovin spécifique a permis d’identifier la protéine de la membrane d’inclusion (IncA) comme un candidat potentiel pour le sérodiagnostic de C. pecorum et de mettre en évidence une séquence répétée codante (CTR) riche en alanine et proline dans le gène incA de C. pecorum. Cette CTR présente des motifs d’acides aminés différents suivant la pathogénicité des souches de C. pecorum. La variabilité génétique de 19 souches de C. pecorum isolées de ruminant a été étudiée par MVLST (multi-virulence sequence typing). Les gènes ompA qui code pour la protéine majeure de la membrane externe, incA et l’ORF663 (cadre ouvert de lecture) permettent de différencier les souches pathogènes de C. pecorum des souches non-pathogènes. Cette hypothèse a été confirmée sur 32 autres souches comprenant 11 souches isolées de porcs. Les souches de C. pecorum isolées de lésions sont génétiquement différentes des souches isolées d’animaux asymptomatiques. Les 3 gènes ompA, incA et l’ORF663 sont des marqueurs moléculaire épidémiologiques potentiels qui pourraient être liés à la virulence de C. pecorum.
-Sequence repetee codante
Chlamydophila pecorum, an obligate intracellular bacterium belonged to Chlamydiaceae family. Screening of a genomic DNA library of C. pecorum by using a specific ovine serum, allowed to identify inclusion membrane protein (IncA) as a potential candidate for C. pecorum serodiagnosis and to highlight a coding tandem repeat (CTR) rich in alanine and proline in the C. pecorum incA gene. The CTR presents several amino acids motifs according to the pathogenesis of C. pecorum strains. The genetic variability of 19 C. pecorum strains isolated from ruminants was studied using MVLST (multi-virulence sequence typing) system. The genes ompA that code for the major outer membrane protein, incA and ORF663 (open reading frame) allowed to distinguish the pathogenic C. pecorum strains from non-pathogenic strains. This hypothesis was confirmed on additional 32 strains including 11 strains isolated from swine. The C. pecorum strains isolated from clinical cases are genetically different from strains isolated from healthy animals. ompA, incA and ORF663 genes are epidemiological molecular markers which could be related to the virulence of C. pecorum.
Source: http://www.theses.fr/2009TOUR4012/document

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 61
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS


ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences, Technologies
ÉQUIPE : Cellule de recherche appliquée – Vaccin Diagnostic
INRA – IASP, Nouzilly

THÈSE présentée par :
Khalil YOUSEF MOHAMAD

soutenue le : 12 octobre 2009


pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François - Rabelais
Discipline/ Spécialité : Sciences de la vie et de la santé

Diversité génétique des souches de
Chlamydophila pecorum:
Recherche et identification des marqueurs
épidémiologiques

THÈSE dirigée par :
Mme. RODOLAKIS Annie Directeur de Recherche, INRA, Nouzilly

RAPPORTEURS :
M. DENAMUR Erick Professeur, Université Paris 7, Paris
M. POSPISCHIL Andreas Professeur, Université Zurich, Zurich, Suisse


JURY :
M. DENAMUR Erick Professeur, Université Paris 7, Paris
M. GARIN-BASTUJI Bruno Directeur de Recherche, AFSSA, Maison Alfort
M. POSPISCHIL Andreas Professeur, Université Zurich, Zurich, Suisse
M. RASSCHAERT Denis Professeur, Université François-Rabelais, Tours
Mme. RODOLAKIS Annie Directeur de Recherche, INRA, Nouzilly

1 Remerciements
Ce travail a été réalisé sous la direction de Dr. Annie Rodolakis, directrice de recherche, et
responsable de l’équipe Cellule de recherche appliquée- vaccin, diagnostic dans l’unité de recherche
Infectiologie animale et santé publique du centre INRA, Nouzilly, France et soutenu par une bourse
financée par l’université d’Al-Furat, Syrie.

Je remercie tout d’abord Annie Rodolakis, pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire pendant
ces 4 années de thèse. Elle a toujours été disponible pour moi, malgré un emploi du temps assez
chargé. Merci Annie pour ton soutien, ta patience et surtout la rigueur scientifique que tu m’as
enseigné.

Je voudrais ensuite remercier les rapporteurs M. Denamur et M. Pospichil et les examinateurs M.
Bruno et M. Rasschaert constituant mon jury de thèse pour m’avoir faire l’honneur d’accepter
d’évaluer ce travail et également aux membres de mon comité de thèse M. Cloeckaert, M. De Ryke, M.
Berri, M. Guatteo et Mme. Laroucau pour avoir suivi ce travail.

Je remercie Abdessalem Rekiki, pour son engagement dans une bonne partie de ce travail. Merci
Abdessalem pour toutes les discussions scientifiques et non scientifiques pendant les deux premières
années de la thèse.

Je tiens à remercie Denis Cochonneau, c’était un plaisir de partager le même bureau avec toi et de
discuter de nos sujets respectifs. Merci pour ta bonne humeur et aussi pour les corrections en
français.

Je tiens aussi à remercier Mustafa Berri pour sa disponibilité et sa sympathie et pour toutes
discussions scientifiques très intéressantes.

Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance aux membres de l’unité IASP-311 pour leurs conseils.

A l’issu de cette thèse, j’aimerais remercier tous ceux qui, d’une façon ou d’une autre, ont participé à
sa réalisation.

Merci AbdulRahman, pour les bons moments passés durant les 6 années en France.

Enfin, je tiens à remercier toute ma famille en Syrie et en France en particulier ma femme Jawhara
pour m’avoir encouragé pendant ces années très longues.
2 Résumé
Chlamydophila pecorum est une espèce bactérienne intracellulaire obligatoire de la famille
Chlamydiaceae. Le criblage d’une banque génomique de C. pecorum en utilisant un sérum
ovin spécifique a permis d’identifier la protéine de la membrane d’inclusion (IncA) comme un
candidat potentiel pour le sérodiagnostic de C. pecorum et de mettre en évidence une
séquence répétée codante (CTR) riche en alanine et proline dans le gène incA de C. pecorum.
Cette CTR présente des motifs d’acides aminés différents suivant la pathogénicité des souches
de C. pecorum.
La variabilité génétique de 19 souches de C. pecorum isolées de ruminant a été étudiée par
MVLST (multi-virulence locus sequence typing). Les gènes ompA qui code pour la protéine
majeure de la membrane externe, incA et l’ORF663 (cadre ouvert de lecture) permettent de
différencier les souches pathogènes de C. pecorum des souches non-pathogènes. Cette
hypothèse a été confirmée sur 32 autres souches comprenant 11 souches isolées de porcs.
Les souches de C. pecorum isolées de lésions sont génétiquement différentes des souches
isolées d’animaux asymptomatiques. Les 3 gènes ompA, incA et l’ORF663 sont des
marqueurs moléculaire épidémiologiques potentiels qui pourraient être liés à la virulence de
C. pecorum.

Mot-clés : Chlamydophila pecorum, diagnostic, marqueur moléculaire, pathogénicité,
MVLST, incA, ompA, ORF663, séquence répétée codante













3 Abstract
Chlamydophila pecorum, an obligate intracellular bacterium belonged to Chlamydiaceae
family. Screening of a genomic DNA library of C. pecorum by using a specific ovine serum,
allowed to identify inclusion membrane protein (IncA) as a potential candidate for C.
pecorum serodiagnosis and to highlight a coding tandem repeat (CTR) rich in alanine and
proline in the C. pecorum incA gene. The CTR presents several amino acids motifs according
to the pathogenesis of C. pecorum strains.
The genetic variability of 19 C. pecorum strains isolated from ruminants was studied using
MVLST (multi-virulence locus sequence typing) system. The genes ompA that code for the
major outer membrane protein, incA and ORF663 (open reading frame) allowed to distinguish
the pathogenic C. pecorum strains from non-pathogenic strains. This hypothesis was
confirmed on additional 32 strains including 11 strains isolated from swine.
The C. pecorum strains isolated from clinical cases are genetically different from strains
isolated from healthy animals. ompA, incA and ORF663 genes are epidemiological molecular
markers which could be related to the virulence of C. pecorum.

Keywords: Chlamydophila pecorum, diagnosis, molecular marker, pathogenesis, MVLST,
incA, ompA, ORF663, coding tandem repeats



















4 Table des matières
Remerciements ......................................................................................................................... 2
Résumé ...................................................................................................................................... 3
Abstract ..................................................................................................................................... 4
Table des matières.................................................................................................................... 5
Liste des figures ........................................................................................................................ 8
Liste des tableaux ..................................................................................................................... 9
Introduction ............................................................................................................................ 13
Revue bibliographique........................................................................................................... 14
Chapitre 1 : Historique et taxonomie de Chlamydiae ......................................................... 15
1. L’historique de Chlamydiae............................................................................................... 15
2. La taxonomie de Chlamydiae............................................................................................. 16
3. Identification des marqueurs épidémiologiques.............................................................. 21
3.1. Sérotypage..................................................................................................................... 22
3.2. Génotypage.................................................................................................................... 22
3.2.1. Hybridation ADN/ADN ......................................................................................... 22
3.2.2. RAPD (Ramdom Amplification of Polymorphic DNA)........................................ 23
3.2.3. PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis)................................................................ 23
3.2.4. AFLP (amplified fragment length polymorphism) ................................................ 24
3.2.5. Profil de restriction de l’ADN génomique total (RFLP)........................................ 24
3.2.6. PCR- RFLP ...................................