Downstream processing of influenza whole-virions for vaccine production [Elektronische Ressource] / von Bernd Kalbfuß-Zimmermann

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• Publié par: otto-von-guericke-universitat_magdeburg
• Publié le: 01 janvier 2009
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Extrait

Downstream Processing of
Influenza Whole-Virions for
Vaccine Production
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
Doktoringenieur (Dr.-Ing.)
von Dipl.-Ing. (FH) Bernd Kalbfuß-Zimmermann
geb. am 17.04.1978 in Mannheim
genehmigt durch die Fakultät für Verfahrens- und Systemtechnik
der Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg
Gutachter:
Prof. Dr.-Ing. Udo Reichl
Prof. Dr.-Ing. Andreas Seidel-Morgenstern
Promotionskolloquium am 11.08.2009Zusammenfassung
Die durch Influenzaviren verursachte Grippe ist ein Atemwegsinfekt, an dem jährlich bis zu 10%
der Weltbevölkerung erkranken. Zusätzlich besteht das unkalkulierbare Risiko einer Pandemie,
welches erst kürzlich durch die Übertragung von Vogelgrippeviren auf den Menschen in das
Bewusstsein der Öffentlichkeit gerückt ist. Vorbeugende Impfung ist gegenwärtig die einzige
wirkungsvolle Maßnahme zum Schutz gegen Influenzaviren. Die Herstellung von sicheren
Influenzaimpfstoffen in ausreichenden Mengen ist daher von großer Bedeutung für die öffentliche
Gesundheitsversorgung. Herkömmlich werden Influenzaviren in befruchteten Hühnereiern
kultiviert. Seit etwa 15 Jahren gewinnt jedoch die Vermehrung in tierischer Zellkultur immer
mehr an Bedeutung. Die Aufreinung von Influenzaviren aus tierischer Zellkultur für die
Herstellung von inaktivierten Ganzvirion-Impfstoffen ist das Thema dieser Arbeit.
Die humanen Influenzaviren A/PR/8/34 (H1N1), A/Wis/67/2005 (H3N2) und B/Mal/2506/2005
wurden in MDCK-Zellen als Wirt gezogen. Ihre Kultivierung in Rollerflaschen wurde hinsichtlich
der Freisetzung der Virionen sowie von Verunreinigungen charakterisiert. Die Bestimmung eines
geeigneten Erntezeitpunkts auf der Basis von statistischen Quantilen der HA-Aktivität, welche
sich durch Interpretation des Freisetzungsprofils als Summenverteilung bestimmen lassen, wird
beschrieben. Die Trübung des Kulturüberstandes, welche die Ablösung der Zellen und deren Lyse
widerspiegelt, wird als ein Marker zur Überwachung des Infektionsfortschrittes vorgeschlagen. In
Abhängigkeit vom Virusstamm und Kulturmedium ergaben sich in Rollerflaschen mittlere HA-
-1Aktivitäten zwischen 130 und 450 HAU (0.1 ml) . Ausgehend von theoretischen Betrachtungen
-1wurde ein Hemagglutinin-Antigenhalt zwischen 0.42 und 1.5 µg ml auf der Basis der
gemessenen HA-Aktivitäten geschätzt. Die mittleren Konzentrationen an Wirtszell-DNA waren
-1mit Werten zwischen 5.9 und 8.9 µg ml vergleichsweise einheitlich. Die
-1 -1Gesamtproteinkonzentration (34 µg ml mit GMEM-basiertem bzw. 62 µg ml mit Ex-Cell
MDCK-Medium) hingegen schien überwiegend vom Kulturmedium abzuhängen bzw. der
Durchführung eines Mediumwechsels vor der Infektion, welche bei GMEM-basiertem Medium
notwendig war. Ausgehend von den Spezifikationen des europäischen Arzneimittelbuches (EA)
und den mittleren Resultaten aus der Viruskultur wurde die Notwendigkeit einer 20 000-fachen
Abreicherung des virusspezifischen DNA-Gehaltes sowie einer 10-fachen Abreicherung des
Proteingehaltes berechnet.
iEs wurden zwei Aufarbeitungsschemata hinsichtlich ihrer Eignung und Einhaltung der zuvor
beschriebenen Anforderungen untersucht. Im ersten Schema wurde der virushaltige
Kulturüberstand mittels zweifacher Normalfluss-Filtration (NFF) geklärt und die Viren im
Anschluss durch Zugabe von -Propiolakton chemisch inaktiviert. Die inaktivierten Viren
wurden mittels Tangentialfluss-Ultrafiltration (TFUF) aufkonzentriert und die Abtrennung des
verbleibenden Wirtszellproteins durch Gelfiltration (GF) erreicht. Die noch enthaltene Wirtszell-
DNA wurde durch Anionenaustausch-Chromatographie (AIEC) im Durchflussverfahren weiter
abgereichert. Die Adsorption der Virionen an die stationäre Phase wurde durch Konditionierung
der virushaltigen Eluatfraktion auf hohe Salzkonzentrationen während der GF erreicht. Die
Gesamtvirusausbeute nach der AIEC betrug 53% basierend auf der HA-Aktivität. Der
virusspezifische Gehalt an Wirtszell-DNA wurde etwa 270-fach, der Gehalt an Gesamtprotein
etwa 15-fach reduziert. Die Abreicherung der Wirtszell-DNA war folglich unzureichend
bezüglich der Forderungen des EA. Die Optimierung der Betriebsbedingungen während der GF
wurde retrospektiv in einer Modellierungsstudie adressiert. Präparationen unter den abgeleiteten
Bedingungen stehen jedoch noch aus.
Im zweiten Schema wurde die Zentrifugation als Alternative zur NFF untersucht. Ihre
Leistungsfähigkeit wurde auf Basis der Sigma-Theorie charakterisiert. Zusätzlich wurde ein
weiterer DNA-Abreicherungsschritt, realisiert durch die selektive Fällung von DNA mittels
Polyethylenimin, in den Prozess aufgenommen. Die Selektivität des Verfahrens konnte durch
Ausführung und Auswertung eines faktoriellen statistischen Versuchsplans („Factorial Design“)
verbessert werden. Der pH-Wert und die Ionenstärke wurden hierbei als kritische Faktoren
identifiziert. Die gefällte DNA wurde durch eine Kombination aus Zentrifugation und
Membranmikrofiltration abgetrennt. Nach Inaktivierung wurde der Virus wieder mittels TFUF
aufkonzentriert; gefolgt von einem Diafiltrationsschritt bei konstantem Volumen zwecks
Abreicherung von Wirtszell-Proteinen und zur Vorbereitung auf die nachfolgende
chromatographische Feinreinigung („Polishing“). Abschließend wurde der Versuch der
adsorptiven Feinreinigung mittels Monolithen und gepackten Betten unternommen. Geeignete
Liganden waren zuvor in Vorversuchen mit Membranadsorbern ermittelt worden. Die
Machbarkeit einer direkten Anreicherung („Capture“) von Influenzaviren aus Kulturüberstand
mittels Anionenaustausch-Membranchromatographie wurde in einem Nebenprojekt belegt.
Obwohl die Charakterisierung des zweiten Schemas noch nicht abgeschlossen ist, kann bereits
von einer zusätzlichen Abreicherung der Wirtszell-DNA um den Faktor 6.5 durch die selektive
iiFällung ausgegangen werden. Die Gesamtabreicherung der Wirtszell-DNA nach Diafiltration
erreichte den Faktor 500, während die Abreicherung nach TFUF im ersten Prozess lediglich den
Faktor 3 beziehungsweise nach GF den Faktor 8 erreichte. Die Gesamtausbeute an Virus war
hingegen, auf Grund der hohen Verluste während der Diafiltration, mit weniger als 50%
vergleichsweise gering. Die mittlere Gesamtausbeute im ersten Prozess betrug 77% nach TFUF
beziehungsweise 65% nach GF. Erste Ergebnisse bezüglich der adsorptiven AIEC mit Monolithen
und gepackten Betten lassen auf die Erreichbarkeit einer endgültigen DNA-Belastung in der
Größenordnung von 10 ng pro Dosis schließen, welche vom EA gefordert wird.
Trotz dieser viel versprechenden Ergebnisse bleibt die Robustheit der adsorptiven AIEC
hinsichtlich weiterer Virusstämme zu überprüfen. Weiterhin ist es wichtig, die Virusausbeuten
nach der Diafiltration zu verbessern. Darüber hinaus verbleibt der mögliche Einfluss
verschiedener Kultivierungssysteme auf die Aufreinigung zu überpüfen und die Charakterisierung
der Virusernten auf Systeme mit Mikroträgern auszudehnen. Abschließend sollte der Gehalt an
Hämagglutinin-Antigen in den aufgereinigten Virussuspensionen mittels
Antikörperpräzipitationstest („SRID assay“) entsprechend den Forderungen des EA bestimmt
sowie die gemessenen DNA-Konzentrationen durch einen zweiten Nachweis überprüft werden,
um die Richtigkeit der präsentierten Werte zu gewährleisten.
iiiivAbstract
Influenza disease caused by influenza viruses is a respiratory disease affecting up to 10% of the
world's population every year. Besides, there is an unforeseeable risk of pandemic influenza,
which has gained public awareness only recently due to infection of human individuals by avian
influenza viruses. Immune-prophylaxis by vaccination currently provides the only effective means
for protection against influenza disease. The preparation of safe influenza vaccines in quantity,
hence, is of eminent importance to public health care. Traditionally, influenza viruses have been
cultivated in fertilized chicken eggs. Since about 15 years, propagation in mammalian cell culture
has been gaining more and more importance. It is the purification of influenza viruses propagated
in cell culture for use in inactivated whole-virion vaccines, which has been investigated in this
work.
Human influenza viruses A/PR/8/34 (H1N1), A/Wis/67/2005 (H3N2) and B/Mal/2506/2005 were
propagated in mammalian cell culture using MDCK cells as a host. Virus propagation in roller
bottles was characterized with respect to the release of virions but also impurities. An appropriate
time for harvesting is suggested based on statistical quantiles of the HA activity by interpreting
release profiles as cumulative distributions. The turbidity of supernatant, reflecting cell
detachment and lysis, is proposed as a maker for monitoring the progress of infection. Depending
on the virus strain and culture medium, average HA activities between 130 and
-1 450 HAU (0.1 ml) were determined in roller bottles. Based on theoretical considerations, an
-1 approximate hemagglutinin antigen content between 0.42 and 1.5 µg ml was estimated from
measured HA activities. Average concentrations of host-cell DNA, in contrast,