Enantioselective enzymatic reduction of prochiral ketones in one-phase and two-phase systems [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Pia Müller

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• Publié le: 01 janvier 2010
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• Langue: Deutsch
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Extrait

Enantioselective Enzymatic Reduction of Prochiral
Ketones in One-Phase and Two-Phase Systems


Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der
RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der
Naturwissenschaften genehmigte Dissertation



vorgelegt von


Diplom-Chemikerin
Pia Müller

aus Engelskirchen



Berichter: Universitätsprofessor Dr. W. Leitner
Universitätsprofesser Dr. U. Schwaneberg



Tag der mündlichen Prüfung: 29.03.2010





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Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen
Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über
http://dnb.d-nb.de abrufbar.
1. Aufl. - Göttingen : Cuvillier, 2010
Zugl.: RWTH Aachen, Univ. Diss., 2010
978-3-86955-325-2
D82 (Diss. RWTH Aachen University, 2010)

© CUVILLIER VERLAG, Göttingen 2010
Nonnenstieg 8, 37075 Göttingen
Telefon: [phone]
Telefax: 0551-54724-21
www.cuvillier.de

Alle Rechte vorbehalten. Ohne ausdrückliche Genehmigung des Verlages ist
es nicht gestattet, das Buch oder Teile daraus auf fotomechanischem Weg
(Fotokopie, Mikrokopie) zu vervielfältigen.
1. Auflage, 2010
Gedruckt auf säurefreiem Papier
978-3-86955-325-2

Abstract

Within this thesis a strategy for the enantioselective synthesis of chiral short chain alcohols
using biocatalysis is developed. This is realized in close collaboration with an industrial
partner. The biocatalysts used are alcohol dehydrogenases (ADH) which need nicotinamide
+ +cofactors (NAD /NADH and NADP /NADPH) as redox equivalents. The regeneration of the
cofactors is done substrate dependent by addition of 2-propanol which is oxidized by the
ADH while the cofactor is reduced, and enzyme dependent. Here, a malate dehydrogenase
(MDH) as second enzyme and L-malic acid as specific substrate are used for in situ cofactor
reduction.
The kinetic characterization of the different ADH preparations and of a NAD- and a
NADP-dependent MDH shows strong dependence of activity on the substrate, on reaction
parameters like concentrations of buffer, substrate, and cofactor, on the type of ADH and on
the kind of preparation, i.e. lyophilized or purified. The obtained results are transferred to
one-phase batch synthesis of (R)- and (S)-2-butanol. Conversion and enantioselectivity (ee)
are dependent on reaction conditions, i.e. 2-propanol and substrate concentration. Generally
it is possible to synthesis both enantiomers of 2-butanol in the one-phase system. Due to
limitations like low conversion, low selectivity, and low substrate solubility the synthesis of
(R)-2-butanol is transferred to two-phase reaction systems using methyl-tert-butyl ether
(MTBE) and the tailor-made ionic liquid (IL) as non-reactive phase. MTBE turns out to be the
solvent of choice. Depending on substrate and co-substrate concentration conversion and ee
can be positively influenced. The same is found for two-phase reactions with MTBE in a
continuous reaction set-up. With the optimum reaction conditions obtained from the batch
experiments conversion and ee are improved. Another influencing factor in the continuous
reaction is the flow rate. ADH and cofactor show exceptionally high stability and high TTN.
Together with further development of a work-up strategy the continuous two-phase reaction
set-up will be a strong tool to produce enantiopure alcohols on preparative relevant scale.










Im Rahmen dieser Arbeit wird eine Strategie zur enzymatischen Synthese niedermolekularer
enantiomerenreiner Alkohole entwickelt. Dies geschieht in enger Zusammenarbeit mit einem
Industriepartner, der verantwortlich für die Entwicklung der Biokatalysatoren ist. Bei den
verwendeten Enzymen handelt es sich um Alkoholdehydrogenasen (ADH), die
+ +Nicotinamidcofaktoren (NAD /NADH and NADP /NADPH) als Redoxäquivalente benötigen.
Die Regenerierung der Cofaktoren wird sowohl substratgekoppelt unter Einsatz von
2-Propanol, welches von der ADH unter Reduktion des Cofaktors oxidiert wird, als auch
enzymgekoppelt realisiert. Hier werden eine Malatdehydrogenase (MDH) als zweites Enzym
und L-Äpfelsäure als spezifisches Substrat für die Cofaktorregenerierung verwendet.
Die kinetische Charakterisierung der verschiedenen ADH-Präparationen, der NAD- und der
NADP-abhängigen MDH zeigt eine deutliche Abhängigkeit der Enzymaktivität vom Substrat,
von Reaktionsparametern wie Puffer-, Substrat- und Cofaktorkonzentration und von der Art
der ADH bzw. der Art der Präparation. Die erhaltenen Ergebnisse werden in ein
Einphasensystem zur Batchsynthese von (R)- und (S)-2-Butanol übertragen. Umsatz und
Enantioselektivität (ee) zeigen eine Abhängigkeit von der 2-Propanol- und der
Substratkonzentration. Im Einphasensystem treten Limitierungen wie niedriger Umsatz,
niedriger ee und schlechte Substratlöslichkeit auf. Generell ist es möglich Synthesen im
Einphasensystem durchzuführen. Aufgrund der Limitierungen werden die gewonnenen
Ergebnisse für die Synthese von (R)-2-Butanol in Zweiphasensysteme mit
Methyl-tert-butylether (MTBE) und einer ionischen Flüssigkeit (IL) als nicht-reaktive Phase
übertragen. MTBE erweist sich als Lösungsmittel der Wahl. Abhängig von Substrat- und
Cosubstratkonzentration können Umsatz und ee positiv beeinflusst werden. Des Weiteren
zeigt sich eine deutliche Verbesserung gegenüber dem Einphasensystem. Übertragen des
Systems in einen kontinuierlich betriebenen Zweiphasenreaktor führt zu einer weiteren
Verbesserung von Umsatz und ee in Abhängigkeit von der Verweilzeit. ADH und Cofaktor
weisen sehr gute Stabilität und hohe TTN auf. Zusammen mit der Entwicklung einer
entsprechenden Strategie für die Aufarbeitung handelt es sich bei dem kontinuierlichen
zweiphasigen Reaktionssystem um einen zuverlässigen Prozess zur Produktion
enantiomerenreiner Alkohole im präparativen Maßstab.



Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von September 2005 bis März 2009 am Institut für
Technische und Makromolekulare Chemie der RWTH Aachen University unter Leitung von
Prof. Dr. Walter Leitner angefertigt.


Acknowledgements

First of all I would like to thank Prof Dr Walter Leitner for the opportunity to work in his
institute, for the excellent working conditions, and the continuous support of my work.

Furthermore, I thank Prof Dr Ulrich Schwaneberg for his willingness to become the
co-examiner in my thesis-committee.

My special thanks go to Dr Lasse Greiner who made this thesis possible in the first place,
supported me over the years, and gave me the necessary freedom for my work I appreciated
so much.

I also would like to say thanks to Shukry Na’amnieh from X-Zyme GmbH for the great
collaboration, fruitful discussions, and continuous supply with enzymes.

My colleagues Daniela Müller, Marrit Eckstein, Christina Kohlmann, Leif Knöpke, and Timo
Koch supported me a lot with discussions about chemistry and topics beyond. Thank you for
that!

I would like to thank the student assistants and research students who worked in my lab and
contributed to this thesis: Thomas Hermanns, Judith Wolff, Susanne Leuchs, Dawid Mosz,
Angela Leung, Ben Bangasser, and Mathias Heinrich.

Many thanks to Frau Eschmann for introducing me to GC analysis and continuously
supporting me whenever questions occured.

Beyond that I thank Timo for his absolut support and his patience.

Finally, I would like to thank my family and especially my mother for their interest in my work
and for their moral support.


I Table of Contents I
I Table of Contents
ABSTRACT .............................................................................................................................. I 
I  TABLE OF CONTENTS .................................................................................................... I 
II  LIST OF SYMBOLS, ABBREVIATIONS, AND ACRONYMS ......................................... V 
1  INTRODUCTION............................................................................................................... 1 
1.1  Biocatalysis using Alcohol Dehydrogenases ........................................................... 1 
1.2  Biocatalysis with Alcohol Dehydrogenases using Two-Phase Systems ............... 7 
1.3  Cofactor Regeneration .............................................................................................. 10 
2  MOTIVATION AND AIM ................................................................................................. 14 
3  KINETIC CHARACTERIZATION OF ENZYMES ..