Establishment of in vitro-infection models for Chlamydia trachomatis based on human primary cells and primary tissue [Elektronische Ressource] / Julia Zielecki. Gutachter: Thomas F. Meyer ; Richard Lucius ; Stefan Bereswill

Julia Zielecki

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• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 30
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 24 Mo

Extrait

Establishment of in vitro-infection models for Chlamydia trachomatis
based on human primary cells and primary tissue


D i s s e r t a t i o n
zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl.-Biol. Julia Zielecki, geb. Schöning
aus Marburg

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Andreas Herrmann

eingereicht am 17.05.2011

1. Gutachter: Prof. Dr. Thomas F. Meyer
2. Gutachter: Prof. Dr. Richard Lucius
3. Gut. Stefan Bereswill

Tag der mündlichen Prüfung: 7.10.2011 Abstract
Abstract
Zellkultursysteme mit Krebszelllinien werden seit Langem zur Untersuchung der Interakti-
on zwischen Pathogenen und ihren Wirtszellen eingesetzt. Diese Systeme eignen sich
aufgrund der reduzierten Komplexität für die Analyse einzelner Faktoren, spiegeln jedoch
nicht den Zustand primärer Zellen oder die komplexe Gewebestruktur wieder. Um die
Beschränkungen zu umgehen, wurden in dieser Arbeit neue Modelle etabliert auf der
Grundlage von reversibel immortalisierten humanen Primärzellen und ex vivo Kultur von
intaktem humanem Eileitergewebe. Infektionen mit dem humanpathogenen Bakterium
Chlamydia trachomatis, welches chronische Schmerzen oder Unfruchtbarkeit auslösen
kann, wurden in diesen Modellen untersucht. Reversible Immortalisierung wurde mit pri-
mären human Eileiterzellen (FT Zellen) und humanen Nabelschnurzellen (HUVEC)
durchgeführt. Das System basiert auf lentiviralem Gentransfer und dem Cre-lox-System.
HUVEC Zellen wurden mit Kombinationen der Onkoproteine hTERT, SV40T und Bmi1
immortalisiert. Immortalisierung von FT Zellen wurde mit SV40T und Bmi1 erreicht. Eine
Analyse der FT Zelllinien zeigte Veränderungen des Karyotyps durch die Immortalisie-
rung. Bemerkenswerterweise konnten die Stammzellmarker CD44 und Oct4 in FT Zellen
nachgewiesen werden. Ex vivo Gewebekultur humaner Eileiter wurde als stabiles Infekti-
onsmodel für Chlamydia trachomatis etabliert. Mittels hochauflösender Konfokal-
mikroskopie wurde gezeigt, dass die Infektion mit C. trachomatis tiefgreifende Verände-
rungen im Epithel der Mukosa auslöst und zum Verlust der Zelladhäsion und Zellpolarität
führt. Ein erhöhter Anteil apoptotischer Zellen wurde nach Infektion mit Serovar D beo-
bachtet, einem klinischen Isolat des Genitaltraktes. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz
zu Infektionen mit dem Laborstamm Serovar L2. Phänotypische Veränderungen in nicht
infizierten Zellen weisen auf die Existenz parakriner Signalwege während der akuten In-
fektion und Veränderung der epithelialen Homeostase hin.

Primärzellen
Reversible Immortalisierung
Eileiter
Chlamydia trachomatis
Abstract
Abstract
Cell culture systems with cancer-derived cell lines have long been used to study the
interaction between pathogens and their host cells. Due to reduced complexity these
systems are convenient for the analysis of single factors; however, they do not represent
the condition of primary cells or the complex tissue structure. To circumvent these
limitations new models were established in this study on the basis of reversibly
immortalized human primary cells and ex vivo culture of intact human fallopian tube
tissue. Infections with the human pathogenic bacterium Chlamydia trachomatis, which
can lead to chronic pain or infertility, were analyzed in these models. Reversible
immortalization was applied to primary human fallopian tube (FT) cells and human
umbilical vein cells (HUVEC). This system is based on lentiviral gene transfer and the
Cre-lox-system. HUVEC cells were immortalized with a combination of two of the
oncoproteins hTERT, SV40T and Bmi1. Immortalization of FT cells was achieved with
SV40T and Bmi1. Analysis of FT cell lines revealed changes of the karyotype induced by
immortalization. Remarkably, the stem cell markers CD44 and Oct4 were detected in FT
cells. Ex vivo tissue culture of human fallopian tubes was established as stable and
reliable infection model for Chlamydia trachomatis. Via high resolution confocal analysis
the infection with C. trachomatis was discovered to trigger profound changes in the
epithelial mucosa, causing loss of cell adhesion and polarity. Interestingly, an increase in
the rate of apoptotic cells was observed after infection with serovar D, a clinical genital
tract isolate. This finding is in contrast to infections with serovar L2, a laboratory strain.
Phenotypic changes in non-infected cells suggest the existence of paracrine signalling
during acute infection and change in epithelial homeostasis.

primary cells
reversible immortalization
fallopian tube
Chlamydia trachomatis

Table of contents
Table of contents
TABLE OF CONTENTS................................................................................................................................1
ZUSAMMENFASSUNG.4
SUMMARY.......................6
1 INTRODUCTION....8
1.1 CHLAMYDIAE.... 8
1.1.1 Taxonomy of chlamydiae ........................................................................................................ 8
1.1.2 Developmental cycle of chlamydiae ...................................................................................... 9
1.2 CHLAMYDIAL DISEASES ................................................................................................................. 10
1.2.1 Medical importance of Chlamydia trachomatis.................................................................. 11
1.2.2 Infections by other chlamydial strains ................................................................................. 11
1.2.3 Effects of chlamydiae on fallopian tubes ............................................................................ 12
1.3 CHLAMYDIAE AND APOPTOSIS....................................................................................................... 13
1.3.1 Apoptotic pathways................................................................................................................ 14
1.3.2 Influence of chlamydiae on apoptosis 14
1.4 PRIMARY CELLS AND TISSUE ......................................................................................................... 15
1.4.1 Anatomy of the female genital tract..................................................................................... 16
1.4.2 Epithelia and endothelia........................................................................................................ 18
1.5 IMMORTALIZATION OF PRIMARY CELLS .......................................................................................... 19
1.5.1 Immortalization and transformation 20
1.5.2 hTERT...................................................................................................................................... 22
1.5.3 SV40T....... 22
1.5.4 Bmi1.......... 23
1.6 LENTIVIRUSES 24
1.6.1 Structure of lentiviruses......................................................................................................... 24
1.6.2 Replication cycle of lentiviruses ........................................................................................... 25
1.6.3 Lentiviruses as vectors for genetic transfer........................................................................ 26
1.7 OBJECTIVE .................................................................................................................................... 29
2 MATERIALS AND METHODS..........................................................................................................30
2.1 MATERIALS..... 30
2.1.1 Primary tissue ......................................................................................................................... 30
2.1.2 Cell lines and primary cells................................................................................................... 30
2.1.3 Bacteria..... 30
2.1.4 Cell culture media, supplements and buffers..................................................................... 31
2.1.5 Chemicals and reagents ....................................................................................................... 32
2.1.6 Buffers and solutions ............................................................................................................. 32
- 1 - Table of contents
2.1.7 Antibodies................................................................................................................................33
2.1.8 Primers...... 33
2.1.9 Plasmids... 34
2.1.10 Equipment........................................................................................................................... 35
2.1.11 Kits........ 35
2.1.12 Software and databases ................................................................................................... 35
2.2 CELL CULTURE AND TISSUE PREPARATION........................................................................