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Etude de la régulation et des fonctions d'ArgBP2 associées à son rôle anti-tumoral et aux processus dépendants de l'actine : rôle de ses partenaires moléculaires, de sa phosphorylation et de sa dimérisation, Study of ArgBP2 regulation and function associated to its anti-tumoral role and to actin dependent processes : role of ArgBP2 molecular partners, phosphorylation and dimerization

De
173 pages
Sous la direction de Philippe Soubeyran
Thèse soutenue le 30 novembre 2010: Aix Marseille 2
Le mauvais pronostic du cancer pancréatique est en partie dû à l’acquisition extrêmement rapide de propriétés invasives et métastatiques par les cellules tumorales pancréatiques et à la faible efficacité des thérapies actuelles. Il est donc essentiel d’identifier de nouvelles cibles utiles au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos travaux impliquent directement la diminution de l'expression d'ArgBP2 dans le processus de dérivation ma ligne du pancréas. ArgBP2 est une protéine adaptatrice régulant la dynamique du cytosquelette d’actine et la transduction des signaux. Nous avons montré que l’activité anti-tumoraled’ArgBP2 in vivo est corrélée à une diminution de l’adhésion, de l’étalement et de la migration des cellules cancéreuses pancréatiques in vitro. Dans le but d’identifier les fonctions associées à son rôle anti-tumoral, nous avons recherché de nouveaux partenaires moléculaires d’ArgBP2 et mis en évidence son interaction avec les protéines WAVE (facteurfavorisant la polymérisation de l’actine), la phosphatase PTP-PEST et la protéine adaptatriceCIP4 qui elles-mêmes sont connues pour réguler le cytosquelette d’actine et la motilité cellulaire. De manière intéressante, nous avons montré que PTP-PEST est indispensable à l’inhibition de la migration cellulaire par ArgBP2. Par ailleurs, nos résultats montrentqu’ArgBP2 régule la fonction de WAVE1 en contrôlant sa phosphorylation par la kinase c-Abl et sa déphosphorylation par PTP-PEST. Nous avons en outre montré que CIP4 est aussi un partenaire de WAVE1, phosphorylé par c-Abl, et qu’elle participe à cette régulation. Enfin,nos résultats mettent en évidence un rôle essentiel de la phosphorylation et de la dimérisationd’ArgBP2 dans la régulation de ses interactions avec ses partenaires et de ses fonctions.
-ArgBP2
-Cancer du pancréas
-Protéine adaptatrice
-Cytosquelette d'actine
-Phosphorylation
-Oligomérisation
-Migration cellulaire
-Ahésion cellulaire
The poor prognosis of pancreatic cancer is partly due to the early acquisition of invasive andmetastatic properties by pancreatic tumoral cells and to the limited efficacy of actualtherapies. Thus, the identification of new targets for novel therapeutic strategies is animportant challenge. Our works directly implicate the decrease of ArgBP2 expression in thetumorigenic process of pancreatic cancer. ArgBP2 is an adaptor protein regulating actincytoskeleton dynamics and cell signaling. We found that the anti-tumoral activity of ArgBP2is correlated with the inhibition of the adhesion, spreading and migration of pancreaticcancerous cells. In order to better understand its anti-tumoral function, we searched newpartners for ArgBP2 and identified, among them, WAVE1 (a nucleation promoting factor),the phosphatase PTP-PEST and the adaptor protein CIP4, which are known to regulate actincytoskeleton and cellular motility. Interestingly, we found that PTP-PEST is necessary toArgBP2 mediated inhibition of cell migration. Additionally, we showed that ArgBP2regulates WAVE1 function by controlling its phosphorylation by c-Abl kinase and itsdephosphorylation by PTP-PEST. Moreover we found that CIP4 is also a WAVE1 interactingprotein, phosphorylated by c-Abl, and that CIP4 participates to the ArgBP2 dependent controlof WAVE1. Finally, our results highlight a primordial role of ArgBP2 phosphorylation anddimerization in the control of its interactions with its partners and in the regulation of itsfunctions
Source: http://www.theses.fr/2010AIX22118/document
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UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE (AIX-MARSEILLE II)
Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé
Faculté des Sciences de Luminy

THESE

En vue d’obtenir le grade de


DOCTEUR EN SCIENCES DE L’UNIVERSITE
DE LA MEDITERRANEE
Discipline : Biologie des Eucaryotes

Présentée et soutenue publiquement
par Julie Roignot
le 30 novembre 2010


Etude de la régulation et des fonctions d’ArgBP2 associées à
son rôle anti-tumoral et aux processus dépendants de
l’actine : rôle de ses partenaires moléculaires, de sa
phosphorylation et de sa dimérisation.


Jury :

Jacques MARVALDI Professeur Marseille Président
Philippe Chargé de Recherche, Marseille Directeur de Thèse
SOUBEYRAN INSERM
Jean-Baptiste Professeur Bruxelles Rapporteur
DEMOULIN
Philippe JAY Directeur de Montpellier Rapporteur
recherche, INSERM
Daniel OLIVE Professeur Marseille Examinateur
Jean-Claude Chargé de Recherche, Marseille Examinateur
CNRS LISSITZKY


INSERM U624 « Stress Cellulaire » Université de la Méditerranée
Parc Scientifique et Technologique de Luminy - Case Postale 915
13288 Marseille cedex 9 – France SOMMAIRE
RESUME ................................................................................................................................... 1
SUMMARY ............................................................................................................................... 2
INTRODUCTION .................................................................................................................... 3
I. LE CANCER DU PANCREAS ......................................................................................... 3
II. LE CYTOSQUELETTE D’ACTINE ................................................................................ 4
1. Introduction ................................................................................................................. 4
2. La polymérisation des filaments d’actine .................................................................... 4
3. Rôle de l’actine dans la polarisation cellulaire .......................................................... 15
4. La migration cellulaire ............................................................................................... 17
5. Le rôle de l’actine dans le trafic membranaire .......................................................... 24
III. LA PROTEINE ArgBP2 ................................................................................................ 26
1. La protéine ArgBP2 ................................................................................................... 26
2. Rôles joués par la famille SoHo ................................................................................ 32
IV. Les partenaires d’ArgBP2 : la famille WASP/WAVE, PTPPEST, c-Abl et CIP4 ......... 45
1. Les familles WASP et WAVE ................................................................................... 45
2. La phosphatase PTP-PEST ........................................................................................ 52
3. La kinase c-Abl .......................................................................................................... 58
4. La protéine CIP4 ........................................................................................................ 63
ARTICLE 1 ............................................................................................................................. 67
1. Introduction ............................................................................................................... 67
2. Manuscrit ................................................................................................................... 70
3. Discussion des résultats ............................................................................................. 71
ARTICLE 2 ............................................................................................................................. 76
1. Introduction 76
2. Manuscrit . 77
3. Discussion des résultats ............................................................................................. 78
ARTICLE 3 ............................................................................................................................. 81
1. Introduction ............................................................................................................... 81
2. Manuscrit ................................................................................................................... 83
3. Discussion des résultats ............................................................................................. 84
DISCUSSION ET PERSPECTIVES .................................................................................... 91
!
!BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................. 95

TABLE DES ILLUSTRATIONS
Figures
Figure A Schématisation du mécanisme de nucléation par le complexe Arp2/3 et les formines.
.................................................................................................................................................... 7
Figure B Représentation du « tapis roulant » d’actine. ........................................................... 10
Figure C Modèle de polymérisation dendritique par le complexe Arp2/3 (Figure tirée de
Pollard et al., 2000 [35]) ......................................................................................................... 12
Figure D Les différents types d’organisation des filaments d’actine : exemple de la cellule en
migration. ... 14
Figure E Structure d’ArgBP2 A. .............................................................................................. 29
Figure F Régulation négative de c-Abl par le complexe ArgBP2/c-Cbl. ................................. 34
Figure G Représentation schématique des éléments de signalisation activés via le récepteur à
l’insuline, menant à la translocation de GLUT4 à la membrane plasmique. .......................... 41
Figure H Représentation schématique de WASP, N-WASP et des membres de la famille
WAVE. ...................................................................................................................................... 46
Figure I Architecture proposée pour les complexes WASP, N-WASP et WAVE à l’état inactif.
.................... 48
Figure J Organisation modulaire des protéines de la famille WASP/WAVE et principaux
partenaires. 51
Figure K Représentation schématique de PTP-PEST indiquant le domaine catalytique et les
cinq régions riches en proline (P1 à P5). ................................................................................ 53
Figure L Représentation schématique des isoformes 1a et 1b de la tyrosine kinase c-Abl
humaine. ................................................................................................................................... 59
Figure M Représentation schématique des principaux domaines constituant CIP4. .............. 64
Figure N Modèle proposé de régulation de l’activité de WAVE1 par ArgBP2. ...................... 75
Figure O Modèle de régulation réciproque d’ArgBP2 et de CIP4 par la kinase c-Abl. ......... 79
Figure P Schéma indiquant les domaines SH3 d’ArgBP2 impliqués dans l’interaction avec
ses partenaires WAVE1, PTP-PEST, CIP4 et c-Abl [79, 105, 320]. ....................................... 85
Figure Q ................................................................................................................................... 87
!
!Figure R Modèle de régulation de la dimérisation d’ArgBP2 par sa phosphorylation par c-
Abl. Influence de la phosphorylation et de la dimérisation d’ArgBP2 sur l’interaction
ArgBP2/WAVE 1. ..................................................................................................................... 89

Tableaux
Tableau A Protéines des adhésions focales ............................................................................. 22
Tableau B Table présentant les principaux membres de la famille SoHo, leur organisation
structurale, les partenaires et les fonctions cellulaires connus. .............................................. 31
!
!RESUME

Le mauvais pronostic du cancer pancréatique est en partie dû à l’acquisition extrêmement
rapide de propriétés invasives et métastatiques par les cellules tumorales pancréatiques et à la
faible efficacité des thérapies actuelles. Il est donc essentiel d’identifier de nouvelles cibles
utiles au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos travaux impliquent
directement la diminution de l'expression d'ArgBP2 dans le processus de dérivation maligne
du pancréas. ArgBP2 est une protéine adaptatrice régulant la dynamique du cytosquelette
d’actine et la transduction des signaux. Nous avons montré que l’activité anti-tumorale
d’ArgBP2 in vivo est corrélée à une diminution de l’adhésion, de l’étalement et de la
migration des cellules cancéreuses pancréatiques in vitro. Dans le but d’identifier les
fonctions associées à son rôle anti-tumoral, nous avons recherché de nouveaux partenaires
moléculaires d’ArgBP2 et mis en évidence son interaction avec les protéines WAVE (facteur
favorisant la polymérisation de l’actine), la phosphatase PTP-PEST et la protéine adaptatrice
CIP4 qui elles-mêmes sont connues pour réguler le cytosquelette d’actine et la motilité
cellulaire. De manière intéressante, nous avons montré que PTP-PEST est indispensable à
l’inhibition de la migration cellulaire par ArgBP2. Par ailleurs, nos résultats montrent
qu’ArgBP2 régule la fonction de WAVE1 en contrôlant sa phosphorylation par la kinase c-
Abl et sa déphosphorylation par PTP-PEST. Nous avons en outre montré que CIP4 est aussi
un partenaire de WAVE1, phosphorylé par c-Abl, et qu’elle participe à cette régulation. Enfin,
nos résultats mettent en évidence un rôle essentiel de la phosphorylation et de la dimérisation
d’ArgBP2 dans la régulation de ses interactions avec ses partenaires et de ses fonctions.






1!
!SUMMARY

The poor prognosis of pancreatic cancer is partly due to the early acquisition of invasive and
metastatic properties by pancreatic tumoral cells and to the limited efficacy of actual
therapies. Thus, the identification of new targets for novel therapeutic strategies is an
important challenge. Our works directly implicate the decrease of ArgBP2 expression in the
tumorigenic process of pancreatic cancer. ArgBP2 is an adaptor protein regulating actin
cytoskeleton dynamics and cell signaling. We found that the anti-tumoral activity of ArgBP2
is correlated with the inhibition of the adhesion, spreading and migration of pancreatic
cancerous cells. In order to better understand its anti-tumoral function, we searched new
partners for ArgBP2 and identified, among them, WAVE1 (a nucleation promoting factor),
the phosphatase PTP-PEST and the adaptor protein CIP4, which are known to regulate actin
cytoskeleton and cellular motility. Interestingly, we found that PTP-PEST is necessary to
ArgBP2 mediated inhibition of cell migration. Additionally, we showed that ArgBP2
regulates WAVE1 function by controlling its phosphorylation by c-Abl kinase and its
dephosphorylation by PTP-PEST. Moreover we found that CIP4 is also a WAVE1 interacting
protein, phosphorylated by c-Abl, and that CIP4 participates to the ArgBP2 dependent control
of WAVE1. Finally, our results highlight a primordial role of ArgBP2 phosphorylation and
dimerization in the control of its interactions with its partners and in the regulation of its
functions.
2!
!INTRODUCTION

I. LE CANCER DU PANCREAS
L’adénocarcinome canalaire pancréatique, qui représente la forme la plus fréquente du cancer
pancréatique (90% des cas) est l’un des cancers les plus agressifs et, malgré sa relative rareté,
se place au quatrième rang des causes de morts par cancer. Il est responsable de 2500 décès en
France chaque année. Le pronostic de ce cancer est effroyable, la survie médiane des patients
atteints est de 4 à 6 mois, la survie à un an est de 10% et celle à 5 ans de 3% [1, 2].
Les causes de ce cancer sont mal connues. Il touche deux fois plus d’hommes que de femmes
et 80% des personnes atteintes sont âgées de plus de 60 ans. Les facteurs de risque sont le
tabagisme (risque augmenté d’environ 3%), la pancréatite chronique et l’obésité. Les
personnes ayant subi une gastrectomie présentent aussi un risque accru de développer la
maladie. Il existe un terrain héréditaire chez 5 à 10% des patients. Récemment, il a aussi été
mis en évidence un risque accru chez les patients ayant un groupe sanguin A, B ou AB,
comparé au groupe O [1, 2].
L’une des causes du pronostic effroyable de ce cancer est qu’au moment du diagnostique, la
tumeur est en général déjà à un stade localement avancé ou métastatique. En effet, les
symptômes de la maladie, tels que la douleur, l’ictère et la perte de poids, sont peu spécifiques
[1, 2].
Aujourd’hui encore, la chirurgie constitue le seul traitement curatif. Malheureusement, celle-
ci n’est applicable qu’à 20% des patients et le taux de survie à 5 ans après chirurgie est
inférieur à 20%. Cependant, la chimiothérapie préopératoire et/ou postopératoire par la
gemcitabine associée ou non à d’autres drogues, et combinée ou non à la radiothérapie,
permet d’augmenter légèrement le nombre de patients opérables et la survie de patients après
résection de la tumeur. Dans le cas des tumeurs localement avancées non opérables, ou
métastatiques, le traitement est essentiellement palliatif, quasiment nul en terme de survie, et
vise à soulager la douleur des patients. Dans ce cas le traitement de base est la chimiothérapie
par gemcitabine. La combinaison de la gemcitabine à d’autres drogues comme le 5-
fluorouracil (inhibiteur de la thymidilate synthetase), l’erlotinib (inhibiteur de l’EGFR) ou la
3!
!cisplatin (agent alkylant de l’ADN) peut augmenter faiblement la survie des patients. La
radiothérapie couplée à la chimiothérapie semble aussi légèrement augmenter la survie [2].
Les tumeurs pancréatiques sont très bien caractérisées au niveau génétique, néanmoins les
raisons de leur agressivité particulière sont mal connues. L’oncogène K-ras est muté très tôt
dans 85% des adénocarcinomes pancréatiques. On observe ensuite l’inactivation des gènes
suppresseurs de tumeur p16 (95% des cas), p53 (40-75% des cas), MADH4 (DPC4 ou
SMAD4 ; 55% des cas) [3].

II. LE CYTOSQUELETTE D’ACTINE
1. Introduction
De nombreux processus cellulaires, tels que la polarisation cellulaire, la motilité cellulaire, les
processus d’endo- et d’exocytose et la cytodiérèse dépendent du cytosquelette d’actine.
Le constituant de base du cytosquelette d’actine est la protéine d’actine monomérique
globulaire (actine G), une ATPase de 43 kDa (375 acides aminés) pouvant s’associer en
filaments d’actine filamenteuse (actine F) (Straub, F. B. 1942. Actin, Stud. Szeged. 2 :3-15).
L’actine est la protéine la plus abondante dans la plupart des cellules eucaryotes. Elle
représente 5% de l’ensemble des protéines dans les cellules non musculaires et environ 20%
dans les cellules musculaires. Trois classes d’actine sont présentes dans le cytosol et le
nucleoplasme : l’actine alpha qui est majoritaire dans les cellules musculaires, et les actines
beta et gamma qui sont majoritaires dans les autres types cellulaires [4].

2. La polymérisation des filaments d’actine
2.1. Le filament polarisé d’actine
Les filaments d’actine résultent de l’association « tête à queue » de monomères d’actine G en
un filament hélicoïdal de 5 à 9 nm de diamètre. Par conséquent, dans un filament d’actine
toutes les sous-unités sont orientées dans la même direction et les deux extrémités diffèrent de
manière structurale. Les filaments d’actine possèdent une extrémité dite « positive » (ou
« barbée ») où la polymérisation de l’actine est rapide, et une extrémité négative (ou
4!
!« pointée ») où la polymérisation est plus lente [5-7]. La polymérisation se déroule en 3
phases, une phase de nucléation, une phase de croissance (ou d’élongation) et une phase
d’équilibre.

2.2. La nucléation de l’actine
La nucléation spontanée de l’actine est très inefficace du fait de l’instabilité des dimères et des
trimères d’actine formés. Les cellules contiennent généralement un pool important de
monomères d’actine liés par des protéines comme les profilines et la thymosine !4. Ces
protéines empêchent la nucléation spontanée de nouveaux filaments, et permettent la
mobilisation rapide de monomères pour l’élongation des extrémités de filaments existant.
L’étape de nucléation constitue donc l’étape limitante pour la formation de nouveaux
filaments. De ce fait, l’intervention de divers facteurs de nucléation dont l’activité est
finement régulée est nécessaire. Le monomère d’actine polymérise sous la forme actine-ATP,
puis l’ATP est hydrolysée en ADP dans le filament [8].

2.2.1. Nucléation par le complexe Arp2/3
Le premier nucléateur identifié est le complexe Arp2/3 purifié à partir d’Acanthamoeba
castallanii grâce à son affinité pour la profiline [9]. Le complexe Arp2/3 catalyse la
polymérisation d’un nouveau filament d’actine (filament fille) sur le flanc d’un filament déjà
existant (filament mère), selon un angle de 70°, de manière à générer une structure ramifiée
(Figures A et C) [10, 11]. Ce type de nucléation ramifié ou « dendritique » est utilisé pour
assembler diverses structures telles que les lamellipodes, les vésicules d’endocytose, ou
encore les queues d’actine utilisées par les bactéries intracellulaires pour se propulser dans le
cytoplasme de leur hôte [12].
Le complexe Arp2/3 est formé par l’assemblage stable de 7 sous-unités. Deux sous-unités,
appartenant aux sous-familles Arp2 et Arp3, sont des protéines apparentées à l’actine. Les
autres sous-unités sont appelées ARPC1 (actin-related protein complex-1), ARPC2, ARPC3,
ARPC4 et ARPC5 [12, 13].
Le complexe Arp2/3 seul n’est pas capable d’induire la nucléation de l’actine. Son activité
doit être induite par des facteurs NPF (nucleation promoting factor) [12, 14]. Les facteurs
5!
!NPF les plus étudiés pour le complexe Arp2/3 appartiennent à la famille
WASp/SCAR/WAVE (Chapitre IV-1) [15, 16]. Ils induisent un changement de conformation
du complexe Arp2/3 permettant de rapprocher les sous-unités Arp2 et Arp3, de manière à
mimer un dimère d’actine qui sert de base à la polymérisation du filament [17]. Ils sont aussi
capables de recruter 1 à 2 monomères d’actine, ce qui est une étape critique du processus de
nucléation car le complexe Arp2/3 seul a une faible affinité pour les monomères d’actine [12,
18]. L’activité du complexe Arp2/3 est aussi régulée par la liaison et l’hydrolyse de l’ATP.
6!
!