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Étude du trafic polarisé de la sous-unité GluK3 des récepteurs du glutamate de type kaïnate

De
118 pages
Sous la direction de Françoise Coussen
Thèse soutenue le 18 décembre 2009: Bordeaux 2
Les récepteurs du glutamate de type kaïnate (KAR) jouent une grande variété de rôles dans la régulation de l’activité des réseaux neuronaux. Les KARs sont localisés à la fois dans les domaines pré- et postsynaptiques et sont impliqués dans différents rôles physiologiques tels que la libération de neurotransmetteur, le contrôle de l’excitabilité neuronale. ainsi que l’intégration et la plasticité synaptique (Pinheiro et Mulle 2006). Mon sujet de thèse a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans le trafic subcellulaire et de l'expression polarisée des récepteurs de type kaïnate contenant la sous-unité GluK3. J’ai d’abord essayé de trouver des protéines associées, cytoplasmiques, qui pourraient intervenir dans le trafic de ces récepteurs. Les approches de protéomique que j’ai utilisées n’ont pas donné de résultat. J’ai ensuite tenté de produire des anticorps dans le but de visualiser ces récepteurs dans le cerveau. Malheureusement, je n’ai pas obtenus d’anticorps suffisamment affins pour réaliser ce projet. Par des approches de mutagénése dirigée et d’expression des récepteurs recombinants dans des systèmes hétérologues ou dans des neurones d’hippocampe en culture, j’ai pu mettre en évidence que la sous-unité GluK3 est endocytée par la voie dépendante de la clathrine via un motif di-leucine cytoplasmique. L'endocytose des récepteurs est régulé par l'application d'acide kaïnique et permet une expression polarisée de GluK3b dans les dendrites. Nous avons ensuite développé un projet d'étude du trafic des récepteurs de type kaïnate hétéromériques composés des isoformes GluK3a et GluK3b. Ce projet est actuellement en cours, mais des données préliminaires semblent impliquer la sous-unité GluK3a dans le processus d'exocytose des récepteurs. Il est donc possible que l’association des deux isoformes serait nécessaire au contrôle de l'expression membranaire du récepteur (via GluK3a) et à l'adressage polarisé dans les neurones (via GluK3b). Cette hypothèse doit cependant être encore validée.
-Récepteur de type kaïnate
-Sous-unité GluK3 (GluR7)
-Trafic protéique
-Polarité neuronale
Glutamate is the principal excitatory neurotransmitter in the brain. Glutamatergic synaptic transmission is mediated by three types of ionotropic receptors that have been classified according to their preferential affinity for the agonists NMDARs (N- methyl-D-aspartate receptors), AMPARs (a-amino-3-hydroxy- 5-methylisoazol-4- propionate receptors) and KARs (kainate receptors). Kainate receptors (KARs) are widely expressed in the brain and are present both at pre- and postsynaptic sites and are involved in several physiological functions. There are five subunits of KAR (GluR5-7, KA1 and KA2 or GluK1-5). One of the main project of my laboratory is to understand the function, the traffic and the regulation of GluK3 subunit, that has been involved in different neuronal desorders such as schizophrenia and depression. GluK3(GluR7)-containing KARs are thought to compose pre-synaptic autoreceptors that facilitate hippocampal mossy fiber synaptic transmission. There are two splice variants of GluK3, named GluK3a and GluK3b . GluK3a shares the same export motif as GluK2a in its C-terminal cytoplasmic domain which allows high expression at the plasma membrane in heterologous cell systems and in primary cultured neurons. In contrast, GluK3b seems to be retained in the endoplasmic reticulum (ER) and is only detected at the plasma membrane in substantial amounts when co-expressed with GluK3a. In my thesis, I have been interested in the mechanisms of polarized trafficking of GluK3 with a main focus on GluK3b. I have been able to identify molecular mechanisms that underlie the polarized trafficking of KARs composed of the GluK3b splice variant. Endocytosis followed by degradation is driven by a di-leucine motif on the cytoplasmic C-terminal domain of GluK3b both in heterologous cells and in cultured hippocampal neurons. The internalization of GluK3b is clathrin and Dynamin2 dependent. Moreover, endocytosis of GluK3b in neurons is regulated by bath application of the KAR agonist kainate. Interestingly, the preferential subcellular localization of GluK3b in dendrites or axons depends on the endocytotic process. We submitted a paper to J. of Neurosciences that show that the subcellular localization of GluK3b depends on the dynamic regulation of an endocytic process that could control the polarized trafficking of KARs in neurons in an activity- dependent manner. I also developped a second project focus on the traffic of KARs expressed as heteromers (GluK3b assembled with GluK3a). I am actually working on this project in my lab in order to send a second paper in the next months.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21686/document
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Université Victor Segalen Bordeaux 2
Année 2009
THÈSE
pour le
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2

Mention : Sciences Biologiques et Médicales
Option : Neurosciences et Pharmacologie

Présentée et soutenue publiquement
Le 18 Décembre 2009
Par Déborah HUYGHE
Née le 22 Décembre 1982 à Bordeaux


Étude du trafic polarisé de la sous-unité GluK3 des
récepteurs du glutamate de type kaïnate



Membres du Jury
DARGENT Bénédicte Directeur de Recherche CNRS Rapporteur
FAIVRE-SARRAILH Catherine Directeur de Recherche CNRS Rapporteur
LANG Jochen Professeur Université Bordeaux 1 Examinateur
MARTIN Stéphane Chargé de recherche CNRS Examinateur
COUSSEN Françoise Chargé de Recherche CNRS Directeur de thèse








Je croyais bien faire. Mais rien ne va jamais comme prévu. Et c’est bien naturel car l’homme
n’est par définition que l’ambition d’être un autre. Un autre mieux. Et puisque qu’il, nous,
sommes destinés, par notre nature même, à rester insatisfaits des autres et de nous-mêmes,
comment espérer jamais une satisfaction durable ? Le monde et ce que l’on peut en obtenir
n’étant qu’éphémère et voué à la destruction, j’affirme ici que l’aspiration au bonheur n’est
rien d’autre qu’un rêve inaccessible… et la science l’outil que j’ai trouvé pour ne jamais me
réveiller…
2

REMERCIEMENTS
Je tiens avant tout à remercier les membres du jury qui ont accepté d’évaluer ce travail et
m’honorent de leur présence : le Dr. J. Lang, le Dr. B. Dargent, le Dr. C. Faivre-Sarrailh et le
Dr. S. Martin.
Je remercie Christophe Mulle pour m’avoir accueillie dans son laboratoire et dans son
équipe. Je le remercie aussi également pour les trois années écoulées dans un
environnement scientifique aussi stimulant et dans des conditions de travail aussi agréables.
Merci au Ministère de la Recherche et de l’enseignement supérieur et à la FRM pour le
soutien financier au cours de ces trois années.
Je remercie Françoise Coussen de m’avoir fait confiance et de m’avoir soutenue durant ces
trois années de thèse. Je ne saurais pas dire où commence et où s’arrête sa contribution à
la personne que je suis aujourd’hui, mais elle est à la hauteur des difficultés et des
satisfactions que nous avons partagées. C'est-à-dire, immense.
Merci aussi à… tout le monde. A tous ceux qui m’ont aidé dans mon projet, de près ou de
loin, je dédis ce modeste paragraphe. Je remercie tout spécialement David, qui, par son
écoute attentive et ses conseils judicieux, a contribué à l’avancement de mon projet. Merci
aussi à tous les interlocuteurs dont j’ai usé et abusé pour parler de mon projet : Christophe,
Agnès, Delphine, Peggy, Nelson, Mario, Eric, Béa, Magali…. Merci aussi à nos ingénieurs de
chocs, sans qui nous ne serions rien… merci aux ingénieurs de la PICIN pour leur aide
décisive, et merci aussi à Jérôme et Julie pour leur aide administrative et amicale.
Parce que, le 12 juillet 2008, il m’a fait une maxiprep du mutant 164, mais surtout parce qu’il
est lui, je remercie Poussin, alias Arnaud. Je remercie aussi les personnes qui m’ont rendu
ce laboratoire spécial et unique au monde : Johanna, Jessica, Shankar, Paulo, Fred, Lucie,
Damien, Julien, Julien, Ronan, Laure, Marie-Charlotte, Delphine, Helge, Virginie…
Merci à aussi à tous ceux qui étaient là sans y être et sans qui la vie serait bien triste :
Pascaline, Vanessa, Fred et mes super colocs bombasses que j’adore, Mélanie et Virginie.
Merci à ma famille, pour avoir été et être mes piliers sans plier. Et merci à toi.
3
SOMMAIRE


SOMMAIRE ............................................................................................................................. 4

RESUME................................. 6

INTRODUCTION ..................................................................................................................... 7
I. L’hippocampe : généralités.......................... 7
II. Les neurones............... 8
1) Généralités................................................................................................ 8
2) Trafic des protéines dans les neurones. 11
• Biosynthèse et maturation.................. 11
• Trafic entre le RE et l’appareil de Golgi ............................................................. 12
• Endocytose ........................................................................ 15
• Les voies d’endocytose...................................................... 17
• Recyclage et Dégradation.................................................. 22
• Expression polarisée des protéines neuronales................ 23
3) Les synapses ......................................................................... 26
• Les synapses électriques................................................... 26
• Les synapses chimiques.................................................... 26
• La synapse glutamatergique.............. 27
III. Les récepteurs du glutamate..................................................... 31
1) Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR)....... 31
2) Les récepteurs ionotropiques du glutamate (iGluR).............. 32
• Les récepteurs de type NMDA (NMDAR) .......................................................... 33
• Les récepteurs de type AMPA (AMPAR)........................... 34
3) Les récepteurs de type kaïnate (KAR)................................... 34
• L’acide kaïnique ................................................................. 35
• Physiopathologies des récepteurs de type kaïnate............ 35
• Clonage et structure des sous-unités des KAR ................................................. 36
• Pharmacologie des KAR .................................................... 37
• Propriétés électrophysiologiques des KAR recombinants ................................. 39
• Rôles des KAR dans la transmission synaptique............... 40
• Localisation ........................................................................ 42
4 IV. La sous-unité GluK3............................................................................................... 46
1) Historique ............................................. 46
2) Physiopathologies.. 49
3) Structure et caractéristiques cinétiques ................................................................. 50
4) Trafic ............................................. 51
• Mécanismes du trafic subcellulaire.... 51
• Trafic polarisé..................................................................... 52
• Mécanismes de régulation du trafic... 54

MATERIELS ET METHODES ............................................................................................... 55
I. Biologie Moléculaire................................... 55
II. Cultures cellulaires..... 55
III. Biochimie ................................................................................................................... 56
IV. Immunocytochimie et Imagerie.................. 59
V. Electrophysiologie...................................................................................................... 60

RESULTATS et DISCUSSION.............................. 62
I. Problématique............................................................................................................ 62
II. Projet 1 : Caractérisation des partenaires protéiques impliqués dans le trafic de la
sous-unité GluK3............... 63
III. Projet 2 : Etude du trafic polarisé des KAR contenant la sous-unité GluK3. ............. 65
1) Projet 2.1 : Etude de la localisation de la sous-unité GluK3 dans le cerveau........ 65
2) Projet 2.2 : Etude des mécanismes impliqués dans le trafic polarisé et subcellulaire
de la sous-unité GluK3. Article............................................................. 70
3) Projet 2.3 : Etude du trafic subcellulaire des KAR composés des isoformes GluK3a
et GluK3b. ................................ 96

PERSPECTIVES ................................................................................. 105

BIBLIOGRAPHIE................................................. 108


5 RESUME

Les récepteurs du glutamate de type kaïnate (KAR) jouent une grande variété de rôles dans
la régulation de l’activité des réseaux neuronaux. Les KARs sont localisés à la fois dans les
domaines pré- et postsynaptiques et sont impliqués dans différents rôles physiologiques tels
que la libération de neurotransmetteur, le contrôle de l’excitabilité neuronale ainsi que
l’intégration et la plasticité synaptique (Pinheiro et Mulle 2006). Mon sujet de thèse a
consisté à étudier les mécanismes impliqués dans le trafic subcellulaire et de l'expression
polarisée des récepteurs de type kaïnate contenant la sous-unité GluK3.
J’ai d’abord essayé de trouver des protéines associées, cytoplasmiques, qui pourraient
intervenir dans le trafic de ces récepteurs. Les approches de protéomique que j’ai utilisées
n’ont pas donné de résultat. J’ai ensuite tenté de produire des anticorps dans le but de
visualiser ces récepteurs dans le cerveau. Malheureusement, je n’ai pas obtenus d’anticorps
suffisamment affins pour réaliser ce projet.
Par des approches de mutagénése dirigée et d’expression des récepteurs recombinants
dans des systèmes hétérologues ou dans des neurones d’hippocampe en culture, j’ai pu
mettre en évidence que la sous-unité GluK3 est endocytée par la voie dépendante de la
clathrine via un motif di-leucine cytoplasmique. L'endocytose des récepteurs est régulé par
l'application d'acide kaïnique et permet une expression polarisée de GluK3b dans les
dendrites.
Nous avons ensuite développé un projet d'étude du trafic des récepteurs de type kaïnate
hétéromériques composés des isoformes GluK3a et GluK3b. Ce projet est actuellement en
cours, mais des données préliminaires semblent impliquer la sous-unité GluK3a dans le
processus d'exocytose des récepteurs. Il est donc possible que l’association des deux
isoformes serait nécessaire au contrôle de l'expression membranaire du récepteur (via
GluK3a) et à l'adressage polarisé dans les neurones (via GluK3b). Cette hypothèse doit
cependant être encore validée.

6 INTRODUCTION

I. L’hippocampe : généralités

Le cortex cérébral évolue du pallium telencéphalique par l’arrangement de neurones en une
seule couche de cellules présente chez les reptiles et les mammifères mais pas chez les
poissons, les amphibiens et les oiseaux. Le pallium telencéphalique des vertébrés peut être
subdivisé en pallium latéral, dorsal et médian donnant lieu respectivement aux structures du
cortex olfactif, du néocortex et de l’hippocampe. L’hippocampe (du grec hippos : cheval, et
kampé : courbure) est situé dans la face médiane du lobe temporal. Il s’agit d’une structure
cérébrale bilatérale et symétrique, composée d’une seule couche de cellules repliée sur elle-
même formant un circuit neuronal tri-synaptique (Figure 1). L’hippocampe est composé du
gyrus dentelé (DG) et de la Corne d’Ammon (CA), elle-même subdivisée en quatre régions
distinctes (CA1, CA2, CA3, CA4). Le DG est composé de trois couches successives : le
stratum moleculare, le stratum granulosum et la couche polymorphique. La CA est
composée de six couches : l’alveus, le stratum pyramidal, le stratum radiatum, le stratum
lacunosum et le stratum moleculare. Dans la région CA3, une couche spécifique est
présente entre le stratum radiatum et pyramidal, appelé stratum lucidum. Cette région nous
intéresse particulièrement car il s’agit de la zone de projection des axones des fibres
moussues sur les neurones pyramidaux de CA3. Nous développerons les fonctions et les
régulations des récepteurs de type kaïnate au niveau des synapses entre les fibres
moussues et les cellules de CA3 au cours des paragraphes suivants.

Figure 1 : Schéma des voies de transmissions dans l’hippocampe chez le rat (Figure tirée
de www.vetopsy.fr/comp/mem/mlt_bn3hippo.php).


7
Les structures para-hippocampiques sont le cortex entorhinal (entrée) et le subiculum
(sortie). Il existe quatre voies principales de transmission de l’information dans l’hippocampe.
Les axones du cortex entorhinal se projettent sur les dendrites des cellules granulaires du
gyrus dentelé et sur les cellules pyramidales de CA3, CA1 et du subiculum et constituent la
voie perforante. Les cellules granulaires contenues dans le gyrus dentelé projettent leurs
axones (fibres moussues) vers la zone CA3. Les axones des cellules pyramidales de la zone
CA3 se projettent vers les dendrites des cellules pyramidales de la zone CA1 (collatérales de
Schaffer). Celles-ci projettent à leur tour leurs axones vers le subiculum.
Différentes pathologies ont été associées à des dysfonctions de la structure de l’hippocampe
telles que la maladie d’Alzheimer (Raji et al., 2009), la schizophrénie, la dépression
chronique, le stress post-traumatique et la démence (pour revue, voir (McEwen, 1999)).
L’hippocampe a un rôle fondamental dans les mécanismes d’apprentissage et de
mémorisation. Ces rôles physiologiques ont été mis en évidence grâce à cinq principales
observations : (1) des dommages au niveau de l’hippocampe déclenchent chez des patients
une amnésie antérograde (2) chez les animaux, des lésions dans l’hippocampe conduisent à
des déficits au niveau de l’apprentissage et la mémorisation (3) des connections
anatomiques suggèrent un réseau de mémoire auto associatif (4) la décharge de certains
neurones, appelés cellules de lieu, est modulée par la localisation dans l’espace (5) les
synapses de l’hippocampe développent une potentiation à long et à court termes (Guzowski
et al., 2004).

II. Les neurones
1) Généralités
En 1888, Santiago Ramon y Cajal, histologiste, donna la preuve morphologique irréfutable
que chaque cellule nerveuse est une entité indépendante (Cajal, 1888). Il découvrit aussi le
circuit de transmission neuronal : l’information qui arrive au niveau des dendrites est ensuite
transmise au soma puis à l’axone (Figure 2) (Cajal, 1892). Toutefois, c’est au physiologiste
Heinrich Wilhelm Von Waldeyer que l’on doit le terme « neurones » (Lopez-Munoz and
Alamo 2009; Waldeyer 1891).
Les neurones constituent l'unité fonctionnelle du système nerveux. On estime que le cerveau
humain comprend environ 100 milliards de neurones. Bien que les neurones soient 10 à 50
fois moins nombreux que les cellules gliales, ce sont eux qui pe
rmettent la transmission de l’information nerveuse. Les cellules gliales sont les seconds
composants du tissu nerveux assurant plusieurs fonctions dont le soutien et la nutrition des
neurones (Haydon, 2001). Les neurones comportent deux domaines distincts, la partie
8 centrale contenant le noyau appelée corps cellulaire ou soma et les nombreux
prolongements (neurites) disposés en rayon en partant du soma. Ces derniers sont divisés
en deux catégories : les axones et les dendrites impliqués dans la réception, le traitement et
la transmission de l’information. Les neurones possèdent en général un seul axone et de
multiples dendrites. Les dendrites et les axones se différencient à la fois par leur
morphologie, leur propriétés de transmission de signal, la composition de leur cytosquelette
et de leur organelles et enfin par leurs fonctions physiologiques (Figure 2) (Craig and Banker
1994; Fukata et al. 2002).

Figure 2 : Schéma de la morphologie d’un neurone.
(Figure tirée de http://www.ratoupedia.org/wiki/Syst%C3%A8me_nerveux)



Les dendrites sont le prolongement du corps cellulaire dont elles partagent les organelles
subcellulaires (reticulum endoplasmique, appareil de Golgi, endosomes). Ce point sera
développé dans le paragraphe sur la polarisation neuronale.
Les dendrites servent à recevoir et à conduire l’influx nerveux au moyen des nombreuses
synapses dont ils sont couverts. Ils se présentent sous la forme d’une arborescence en
extension à partir du soma. Ces structures sont courtes et épaisses lorsqu’elles émergent du
corps cellulaire, puis leur diamètre décroît avec leur longueur. Les branches dendritiques se
forment en Y.
L’axone est le siège de la création et de la propagation des potentiels d’action (PA). Il s’agit
d’une structure longue et fine présentant un diamètre uniforme sur sa longueur mais qui peut
varier entre cellules (de 1 à 15 µm) ce qui aura une incidence directe sur la vitesse de
propagation de l’influx nerveux. Les plus longs axones du corps humain appartiennent au
faisceau pyramidal, sont issus de la couche V du cortex sensorimoteur et se terminent au
sein de la moelle lombosacrée ; les plus longs étant probablement ceux contrôlant les
muscles interosseux permettant de déplacer les orteils de gauche à droite.
9 L’origine de l’axone se situe dans une partie appelée cône axonique qui s’amincit pour
former le segment initial de l’axone. Les axones peuvent ensuite se prolonger et se diviser
en plusieurs branches (collatérales axoniques) qui se forment à angles droits. L’axone se
termine par une zone appelée bouton terminal, site de contact avec un autre neurone ou
cellule que l’on appelle synapse (de Castro et al. 2007; Fukata et al. 2002).
Figure 3 : Stades de développement des neurones issus de l’hippocampe en culture. Les
neurones acquièrent leur morphologie polarisée en 5 stades différents (figure tirée de
(Fukata et al., 2002)).

Dans les années 80, différentes études sur des neurones en culture ont mis en évidence
qu’après huit jours in vitro, les neurones possèdent deux domaines distincts
(axone/dendrites) différents par leur morphologie (Bartlett and Banker 1984a; Bartlett and
Banker 1984b), leur synthèse protéique (Davis et al., 1987), certains éléments de leur
cytosquelette (Caceres et al. 1984; Caceres et al. 1986; Shaw et al. 1985), et leur polarité
synaptique (Bartlett and Banker, 1984). Le développement des neurones en culture peut se
diviser en cinq stades : immédiatement après la mise en culture des cellules, des
lamellipodes mobiles se forment au tour du soma (stade 1). Quelques heures après, les
lamellipodes se transforment en neurites différenciés d’une longueur de 10 à 15 µm (stade
2). Au cours des heures suivantes, l’axone se forme et se développe ce qui (stade 3)
correspond à la mise en place de la polarité cellulaire. Après quatre jours en culture, la
10