Expression and regulation of the porin gene mspA of Mycobacterium smegmatis [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Dietmar Hillmann

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• Publié par: friedrich-alexander-universitat_erlangen-nurnberg
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 10
• Langue: English
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Extrait

Expression and regulation of the porin gene mspA
of Mycobacterium smegmatis







Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades














vorgelegt von
Dietmar Hillmann
aus Nürnberg



Als Dissertation genehmigt
von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Universität Erlangen-Nürnberg

























Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2006
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. M. Niederweis
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. A. Burkovski Index

Index


1 Zusammenfassung / Summary 1


2 Introduction 2

2.1 The genus Mycobacterium
2.1.1 Taxonomy
2.1.2 The architecture of the mycobacterial cell wall 3
2.2 Porins: Structure and function in gram-negative bacteria 5
2.3 Mycobacterial porins 7
2.4 Porin regulation 10
2.5 Expression of mspA of M. smegmatis 12
2.6 Scope of the thesis 13


3 Results 14

3.1 Screening system to monitor mycobacterial promoter activity 14
3.2 Transcriptional mechanisms affecting mspA expression 18
3.2.1 Identification of the mspA promoter 18
3.2.2 A very long upstream DNA element is required for full activity of p 22 mspA
3.2.3 Influence of translation initiation signals of p on lacZ expression 24 mspA
3.2.4 Influence of a distal DNA element on p activation 25 mspA
3.2.5 Alignment of the 5’ regions of mspA, mspB, mspC and mspD 27
3.3 Post-transcriptional mechanisms affecting mspA expression 28
3.3.1 Detection of an antisense RNA to the mspA transcript
3.3.2 Secondary structure of the 5’ UTR of mspA 31
3.4 pH dependent mspA expression
3.4.1 mspA expression is repressed at pH 4.5
3.4.2 The repression of mspA at pH 4.5 is a specific event 32
3.4.3 The regulation of mspA at pH 4.5 requires the original 5’ UTR 33
3.4.4 β-galactosidase based monitoring of pH dependent mspA expression 34



- i - Index

4 Discussion 40

4.1 Transcriptional control of mspA expression 40
4.2 f mspA, mspB, mspC and mspD 42
4.3 Post-transcriptional control of mspA expression 44
4.3.1 Stability of the mspA transcript
4.3.2 The 5’ end of the mspA transcript
4.3.3 The 3’ end of the mspA transcript 46
4.3.4 Initiation of translation
4.3.5 Detection of an antisense RNA to the mspA transcripts 47
4.4 Adaptation of mspA regulation to low pH 48
4.5 Conclusions and perspectives 50


5 Material and Methods 51

5.1 Material
5.1.1 Chemicals, equipment and biological material 51
5.2 Media, buffers and solutions 56
5.2.1 Media
5.2.2 Buffers and solutions 57
5.3 General methods 60
5.4 Growth of bacteria
5.5 Transformation of bacteria 61
5.5.1 Transformation of chemically competent E. coli 61
5.5.2 Electroporation of M. smegmatis
5.6 Methods for nucleic acid purification, modification and analysis
5.6.1 Plasmid purification
5.6.2 Preparation of chromosomal DNA from mycobacteria 61
5.6.3 Polymerase chain reaction (PCR) 62
5.6.4 Site-directed mutagenesis by combined polymerase chain reaction (CCR) 62
5.6.5 Phosphorylation of oligonucleotides 63
5.6.6 Primer annealing
5.6.7 Restriction and ligation
5.6.8 Construction of plasmids
5.6.9 RNA preparation 64
5.6.10 Primer extension 65
5.6.11 Northern blot analysis
5.6.12 Dot blot analysis 66
- ii - Index

5.6.13 RNA probe synthesis for Northern and dot blots 66
5.7 Extraction and analysis of proteins 66
5.7.1 Selective extraction of porins of M. smegmatis
5.7.2 Western blot analysis
5.7.3 Alkaline phosphatase activity measurement 67
5.7.4 β-galactosidase activity measurement
5.8 Computer analyses 68
5.8.1 GeSTer


6 References 69


7 Appendix 79

7.1 Use of phoA for pH dependent mspA expression 79
7.2 C FDG as an alternate substrate for the β-galactosidase 80 2
7.3 MspA amounts during growth at pH 4.5 83
7.4 List of predicted transcriptional terminators of M. tuberculosis 83
7.5 Abbreviation index 85


- iii - Zusammenfassung

1 Zusammenfassung

Aufgrund ihrer einzigartigen und lipidreichen Zellwand sind Mycobakterien resistent
gegenüber einer Vielzahl von Antibiotika. Die Diffusion hydrophiler Substanzen über diese
Permeabilitätsschranke erfolgt mit Hilfe wassergefüllter Kanalproteine, der so genannten
Porine. Die Anpassung an sich ändernde Umwelteinflüsse stellt einen Kompromiss zwischen
der Aufnahme von Nährstoffen und dem Ausschluss toxischer Substanzen dar und wird in
gram-negativen Bakterien durch ein komplexes Regulationsnetzwerk erzielt. Bisher war es
jedoch unklar, wie die Expression der Poringene in Mycobakterien reguliert wird. Im Rahmen
dieser Arbeit wurden transkriptionelle und post-transkriptionelle Mechanismen untersucht,
die für die Expression von mspA, des Hauptporins in Mycobacterium smegmatis,
verantwortlich sind. Die Verwendung eines Tandem-Terminators bestehend aus den aus
Escherichia coli und dem Bakteriophagen T4 stammenden Terminatoren tt und ttrrnBT2 T4g32
reduzierte die Hintergrundaktivität der lacZ Reporterplasmide in M. smegmatis 14-fach. Die
-10 Region des mspA Promotors wurde durch gezielte Punktmutationen in Verbindung mit
lacZ Reportergenfusionen 142 Basenpaare oberhalb von mspA ermittelt und als einziger
mspA Promotor identifiziert. 200 Basenpaare von Position -500 bis -700 erhöhten die
β-Galaktosidase Aktivität 12-fach und wurden für eine maximale Aktivierung des Promotors
benötigt. Die Insertion von 14 Basenpaaren an Position -500 führte zum Verlust dieser
Aktivierung und deutet auf eine Phasenverschiebung der DNA Helix und auf die spezifische
Bindung eines Aktivators hin. Transkripte, die antiparallel zur untranslatierten Region
oberhalb des mspA Gens sind, wurden mittels Northern Blots detektiert und repräsentieren
möglicherweise eine regulatorische, komplementäre RNA. Sequenzuntersuchungen des 5’
Endes der mspA mRNA deuten auf die Ausbildung einer Stammschlaufe hin. Diese trägt
möglicherweise zu der langen Halbwertszeit der mspA Transkripte von 6 Minuten bei,
vermutlich indem der Angriff von Ribonukleasen durch Ausbildung der Sekundärstruktur
verhindert wird. Northern und Dot Blot Analysen zeigten, dass die Menge der mspA
Transkripte mit sinkendem pH Wert abnahm und bei pH 4.5 nicht mehr detektiert werden
konnte. Episomale Fusionen von mspA mit konstitutiven Promotoren führten zu gleich
bleibenden Transkriptmengen, unabhängig vom pH Wert. Umgekehrt wurden keine lacZ
Transkripte unter der Kontrolle des mspA Promotors bei pH 4.5 nachgewiesen, was darauf
schließen lässt, dass der mspA Promotor spezifisch durch den pH Wert reguliert und dieser
Effekt durch die 5’ untranslatierte Region von mspA vermittelt wird. Die potentiell
komplementäre RNA wurde in gleicher Weise vom pH Wert reguliert wie mspA. Das deutet
auf Stabilisierung der mspA Transkripte oder Begünstigung der Ribosomenbindung durch die
RNA hin. Somit liefert diese Arbeit erste Erkenntnisse über die transkriptionelle und post-
transkriptionelle Regulation der Genexpression von Porinen in M. smegmatis.
- 1 - Summary

1 Summary


Mycobacteria possess a unique, lipid-rich cell envelope which strongly contributes to their
intrinsic resistance against many antibiotics. Hydrophilic compounds cross this permeability
barrier by diffusion through transmembrane channel proteins, the so called porins. The
balance of nutrient acquisition and blockade of toxic molecules is crucial for adaptation to
changing environmental conditions and in gram-negative bacteria it is achieved by a complex
network of regulatory circuits. However, it was unknown how e