Expression et évolution des lipases de Candida rugosa et Yarrowia lipolytica pour modifier leurs activités et spécificités, Expression and evolution of lipases from Candida rugosa and Yarrowia lipolytica to modify their activities and specificities

Rungtiwa Piamtongkam

Description

Sous la direction de Alain Marty, Warawut Chulalaksananukul
Thèse soutenue le 22 avril 2010: Universite Chulalongkorn - THAILANDE, INSA de Toulouse
Les lipases, protéines ubiquitaires, sont les enzymes les plus étudiées et les plus utilisées dans l’industrie. Elles catalysent un très grand nombre de réactions, d’hydrolyse et de synthèse, conduisant à une grande diversité de molécules, acides, esters, amides…. Les domaines d’applications sont nombreux : les bio-énergies, les arômes, bio-lubrifiants, bio-plastifiants, émulsifiants, produits phytosanitaires et détergents, cosmétiques, synthons pour la chimie fine, produits pharmaceutiques… Aujourd’hui, grâce aux outils génétiques, il est possible de modifier leur activité, spécificité et thermostabilité pour les adapter idéalement aux contraintes industrielles. Dans ce travail de doctorat, nous nous sommes intéressés à quatre lipases d’intérêt industriel. Les 3 premières appartiennent à la famille des lipases de Candida rugosa (Lip1, Lip3 et Lip4). Bien que très homologues, leurs spécificités sont très différentes. Elles se distinguent de toutes les autres lipases par un site actif composé d’un long tunnel avec la triade catalytique à l’entrée de celui-ci. Cela en fait une enzyme particulièrement intéressante pour la conversion et la purification d’acides gras à longue chaîne. La quatrième est une nouvelle lipase identifiée chez la levure oléagineuse, Yarrowia lipolytica. Elle est très active sur les acides gras à longue chaîne, active à pH acide et présentant une grande énantiosélectivité sur des molécules d’intérêt pharmaceutique, les esters d’acide 2- halogéno-aryl acide acétique. Dans un premier temps, un nouveau système d’expression, une souche spécifique de Yarrowia lipolytica, a été étudié pour l’expression de variants construits par mutagenèse dirigée. Cette souche JMY1212 permet une intégration ciblée dans le génome de Y. lipoytica. Nous avons démontré qu’il s’agissait du premier système d’expression permettant de comparer statistiquement l’activité de variants directement à partir du surnageant de culture. Trois des lipases de Candida rugosa ont été clonées avec succès dans cette souche et leurs activités et spécificités vis-à-vis de la longueur de chaines des acides gras ont été étudiées. Lip1 et Lip3 présentent une spécificité pour les acides gras à longueur de chaine moyenne (C8-C10) alors que Lip4 préfère les C18:1. De, plus, pour la première fois, la purification, à partir d’un mélange d’esters éthyliques issu d’huile de poissons, d’acides gras poly-insaturés (PUFAs); acides cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic (EPA) et cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic (DHA), molécules bonnes pour la santé, a été réalisée avec les trois lipases séparées de C. rugosa. Quelle que soit l’enzyme, le rendement de récupération du DHA est supérieur à 93 % (97, 100 et 93 % pour Lip1, Lip3 et Lip4 respectivement. Une pureté maximale en DHA de ~60 % a été obtenue avec Lip3 et Lip4, à partir d’un mélange initial d’esters éthyliques contenant 25% de DHA. Une différence remarquable entre ces trois enzymes est que Lip4 est capable de mieux hydrolyser l’ester d’EPA (60% contre 14 et 16% pour Lip1 et Lip3). Lip4 est même capable d’hydrolyser le DHA (7% contre 3 et 0 % pour Lip1 et Lip3). La deuxième partie de ce travail a été consacrée à l’amélioration de l’énantiosélectivité des deux enzymes étudiées vis-à-vis de synthons d’intérêt dans l’industrie pharmaceutique, les esters de 2-bromo aryl acide acétique. La construction raisonnée d’un double variant de la lipase Lip2 de Y. lipolytica, D97AV232F, a permis d’obtenir une enzyme totalement énantiosélective (E >200). Celle-ci reconnaît l’énantiomère R alors que la lipase sauvage avait une faible préférence pour l’énantiomère S (E=5). Par ailleurs, cette exceptionnelle augmentation de l’énantiosélectivité s’accompagne d’une amélioration de l’activité de l’enzyme qui est ainsi multipliée par 4,5. Sur ce même mélange d’énantiomères, les 3 lipases de C. rugosa se sont avérées remarquables. Malgré leur grande homologie, leur spécificité est différente. Lip1 et Lip3 sont totalement S spécifiques (E>200), alors que Lip4 est R spécifique (E=15). Le docking moléculaire des énantiomères S et R dans le site actif des lipases Lip1 et Lip4 a permis de mieux comprendre ces différences de spécificité et de proposer des cibles de mutagenèse dirigée. L’encombrement et la nature de l’acide aminé présent en position 296 sont cruciaux pour la discrimination de l’enzyme
-Lipase
-Candida rugosa
-Yarrowia lipolytica
-Évolution dirigée
-Système d’expression
-Mutagenèse
-Modélisation moléculaire
-Résolution de mélanges racémiques
-Purification de DHA
Lipases, ubiquitous proteins, are the most studied enzymes and the most used in industry. They catalyse a great number of reactions, hydrolysis and synthesis, leading to a great diversity of molecules, acids, esters, amides. There are numerous fields of applications: bio-energies, flavours, bio-lubricants, bio-plasticizers, emulsifiers, detergents, cosmetics, synthons for fine chemistry, and pharmaceutical products. Nowadays, thanks to genetic tools, it is possible to modify their activity, specificity and thermostability to ideally adapt enzymes for the industrial constraints. In this work, we were interested in four lipases of industrial interest. The third ones belong to the lipase family of Candida rugosa (Lip1, Lip3 and Lip4). Although they present high homology, their specificities are very different. They are distinct from the other lipases by the active site composed of a long tunnel with the catalytic triad at the entry of the tunnel. It leads to enzymes particularly interesting for the conversion and the purification of long chain fatty-acids. The fourth one is a new lipase identified from oleaginous yeast, Yarrowia lipolytica. It is one of the most active lipase on long chain fatty-acids; it is very active and stable at acid pH and presents a high enantioselectivity on molecules of pharmaceutical interest, the esters of 2- halogeno-aryl acetic acid. In this work, we first tested a new expression system, a specific strain of Y. lipolytica, for expression of variants obtained by site-directed mutagenesis. This strain JMY1212 enables integration to be targeted to a special locus of the Y. lipoytica genome. We demonstrated that it is the first expression system in which it is possible to compare statistically variant activities directly from the supernatant of the culture. Secondly, three lipases of C. rugosa were cloned successfully in this strain and their activities and specificities with respect to fatty acid chain lengths were studied. Lip1 and Lip3 have specificity for the fattyacids of medium chain (C8-C10) whereas Lip4 prefers C18: 1. Moreover, for the first time, purification, from a mixture of ethyl esters issued from fish oil, polyunsaturated fatty acids (PUFAs); cis-5, 8, 11, 14, 17- eicosapentaenoic acid (EPA) and cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic acid (DHA), molecules with health benefits, was realised with the three C. rugosa lipases, separately. Whatever the enzyme the recovery of DHA is superior to 90 % (97, 100 and 93 % for Lip1, Lip3 and Lip4 respectively. The maximal DHA purity ~60 % was obtained with Lip3 and Lip4, with an initial ethyl ester mixture containing 25% DHA. A remarkable difference between these enzymes lies in the fact that Lip4 is able to better hydrolyse the EPA esters (60% against 13% and 16% respectively for Lip1 and Lip3). Lip4 is also able to hydrolyse DHA (7% against 3 and 0 % for Lip1 and Lip3 respectively). The third part of this work was devoted to the improvement of the enantioselectivity of the two enzymes studied with respect to the resolution of a racemic mixture of pharmaceutical industry, the R, S esters of 2-bromo aryl acetic acid. The rational construction of a double variant of Lip2 lipase from Y. lipolytica, D97A V232F was realized to obtain a total enantioselective enzyme (E > 200). This variant recognizes the enantiomer R whereas wild-type lipase had a weak preference for the enantiomer S (E=5). In addition, this exceptional increase in the enantioselectivity is accompanied by a 4.5 fold improvement of the activity. With the same mixture of enantiomers, the 3 lipases of C. rugosa proved to be remarkable from the point of view of enantioselectivity. In spite of their high homology, their specificity is different. Lip1 and Lip3 are completely specific for the S enantiomer, whereas Lip4 is R specific (E=15). The molecular docking of the S and R enantiomers in the active site of Lip1 and Lip4 lipases enables the observed differences in specificity to be better understood and targets for site-directed mutagenesis to be proposed. We demonstrated that the nature of the amino acid present in position 296 is crucial for the discrimination of these enzymes
-Lipase
-Purification of DHA
-Candida rugosa
-Yarrowia lipolytica
-Mutagenesis
-Resolution of racemic mixture
Source: http://www.theses.fr/2010ISAT0015/document

Sujets

• Évolution dirigée
• Mutagenèse
• Modélisation moléculaire

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 80
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

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InstitutNationaldesSciencesAppliquéesdeToulouse(INSAToulouse)
MicrobiologieetBiocatalyseIndustrielles
RungtiwaPiamtongkam
jeudi22avril2010
4ITRE
Expressionandevolutionoflipasesfrom
CandidarugosaandYarrowialipolyticatomodify
theiractivitiesandspecificities
*529
PreedaBoon-Long ChulalongkornUniversité/Président
SiriratRengpipat/Rapporteur
SuphangChulalaksananukul MahidolUniversité/Examinateur
Orathai Chavalparit Chulalongkorn/
%COLEDOCTORALE
SciencesEcologiques,Vétérinaires,AgronomiquesetBioingénieries(SEVAB)
5NITÏDERECHERCHE
Laboratoired'IngénieriedesSystèmesBiologiquesetdesProcédés
RECTEURSDE4HÒSE
AlainMartyetWarawutChulalaksananukul
ThierryChardot
EricDubreucqPROJET DE THESE
présenté devant
Chulalongkorn Université de Thaïlande


en vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE

Spécialité : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries
Filière : Microbiologie et Biocatalyse Industrielles

par


Rungtiwa Piamtongkam


EXPRESSION AND EVOLUTION OF LIPASES FROM
CANDIDA RUGOSA AND YARROWIA LIPOLYTICA TO IMPROVE
THEIR ACTIVITIES AND SPECIFICITIES






Ecole doctorale : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB)
Unité de recherche : Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (UMR CNRS
5504, UMR INRA 792) de l'INSA de Toulouse

2NOM : PIAMTONGKAM Prénom : Rungtiwa

Titre : Expression et évolution des lipases de Candida rugosa et Yarrowia lipolytica pour modifier leurs
activités et spécificités.

Spécialité: Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries
Filière : Microbiologie et Biocatalyse industrielle
Directeurs de thèse: Alain Marty et Warawut Chulalaksananukul
Année : 2010 Lieu : Chulalongkorn Université, Thaïlande N° ordre : 1030 Pages : 199

RESUME :
Les lipases, protéines ubiquitaires, sont les enzymes les plus étudiées et les plus utilisées dans l’industrie. Elles
catalysent un très grand nombre de réactions, d’hydrolyse et de synthèse, conduisant à une grande diversité de
molécules, acides, esters, amides…. Les domaines d’applications sont nombreux : les bio-énergies, les arômes,
bio-lubrifiants, bio-plastifiants, émulsifiants, produits phytosanitaires et détergents, cosmétiques, synthons pour
la chimie fine, produits pharmaceutiques… Aujourd’hui, grâce aux outils génétiques, il est possible de modifier
leur activité, spécificité et thermostabilité pour les adapter idéalement aux contraintes industrielles. Dans ce
travail de doctorat, nous nous sommes intéressés à quatre lipases d’intérêt industriel. Les 3 premières
appartiennent à la famille des lipases de Candida rugosa (Lip1, Lip3 et Lip4). Bien que très homologues, leurs
spécificités sont très différentes. Elles se distinguent de toutes les autres lipases par un site actif composé d’un
long tunnel avec la triade catalytique à l’entrée de celui-ci. Cela en fait une enzyme particulièrement intéressante
pour la conversion et la purification d’acides gras à longue chaîne. La quatrième est une nouvelle lipase
identifiée chez la levure oléagineuse, Yarrowia lipolytica. Elle est très active sur les acides gras à longue chaîne,
active à pH acide et présentant une grande énantiosélectivité sur des molécules d’intérêt pharmaceutique, les
esters d’acide 2- halogéno-aryl acide acétique.
Dans un premier temps, un nouveau système d’expression, une souche spécifique de Yarrowia lipolytica, a été
étudié pour l’expression de variants construits par mutagenèse dirigée. Cette souche JMY1212 permet une
intégration ciblée dans le génome de Y. lipoytica. Nous avons démontré qu’il s’agissait du premier système
d’expression permettant de comparer statistiquement l’activité de variants directement à partir du surnageant de
culture. Trois des lipases de Candida rugosa ont été clonées avec succès dans cette souche et leurs activités et
spécificités vis-à-vis de la longueur de chaines des acides gras ont été étudiées. Lip1 et Lip3 présentent une
spécificité pour les acides gras à longueur de chaine moyenne (C8-C10) alors que Lip4 préfère les C18:1. De,
plus, pour la première fois, la purification, à partir d’un mélange d’esters éthyliques issu d’huile de poissons,
d’acides gras poly-insaturés (PUFAs); acides cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic (EPA) et cis-4, 7, 10, 13, 16,
19-docosahexaenoic (DHA), molécules bonnes pour la santé, a été réalisée avec les trois lipases séparées de C.
rugosa. Quelle que soit l’enzyme, le rendement de récupération du DHA est supérieur à 93 % (97, 100 et 93 %
pour Lip1, Lip3 et Lip4 respectivement. Une pureté maximale en DHA de ~60 % a été obtenue avec Lip3 et
Lip4, à partir d’un mélange initial d’esters éthyliques contenant 25% de DHA. Une différence remarquable entre
ces trois enzymes est que Lip4 est capable de mieux hydrolyser l’ester d’EPA (60% contre 14 et 16% pour Lip1
et Lip3). Lip4 est même capable d’hydrolyser le DHA (7% contre 3 et 0 % pour Lip1 et Lip3).
La deuxième partie de ce travail a été consacrée à l’amélioration de l’énantiosélectivité des deux enzymes
étudiées vis-à-vis de synthons d’intérêt dans l’industrie pharmaceutique, les esters de 2-bromo aryl acide
acétique. La construction raisonnée d’un double variant de la lipase Lip2 de Y. lipolytica, D97AV232F, a permis
d’obtenir une enzyme totalement énantiosélective (E >200). Celle-ci reconnaît l’énantiomère R alors que la
lipase sauvage avait une faible préférence pour l’énantiomère S (E=5). Par ailleurs, cette exceptionnelle
augmentation de l’énantiosélectivité s’accompagne d’une amélioration de l’activité de l’enzyme qui est ainsi
multipliée par 4,5. Sur ce même mélange d’énantiomères, les 3 lipases de C. rugosa se sont avérées
remarquables. Malgré leur grande homologie, leur spécificité est différente. Lip1 et Lip3 sont totalement S
spécifiques (E>200), alors que Lip4 est R spécifique (E=15). Le docking moléculaire des énantiomères S et R
dans le site actif des lipases Lip1 et Lip4 a permis de mieux comprendre ces différences de spécificité et de
proposer des cibles de mutagenèse dirigée. L’encombrement et la nature de l’acide aminé présent en position 296
sont cruciaux pour la discrimination de l’enzyme.
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MOTS CLES :
Lipase, Candida rugosa, Yarrowia lipolytica, évolution dirigée, système d’expression, mutagenèse, modélisation
moléculaire, résolution de mélanges racémiques, purification de DHA
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Soutenance prévue le 22 avril 2010, à l’Université de Chulalongkorn, Thaïlande
Ecole Doctorale : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB)
Cette thèse a été préparée au Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (UMR CNRS 5504, UMR INRA 792) de
l'INSA de Toulouse. Elle a été financée du Royal Golden Jubillee Ph.D. Programme, Thaïlande Recherches Fonds et Ambassade de la
France.
3 4Last name: PIAMTONGKAM First name: Rungtiwa

Title: Expression and evolution of lipases from Candida rugosa and Yarrowia lipolytica to modify their
activities and specificities.

Speciality: Ecological Sciences, Veterinary, Agronomics and Bioengineering
Field: Microbiology and Biocatalysts Industrial
Supervisors: Alain Marty and Warawut Chulalaksananukul
Year: 2010 Place: Chulalongkorn University N° ordre: 1030 Pages: 199

ABSTRACT: