Femtosecond stimulated resonance Raman spectroscopy [Elektronische Ressource] : towards mapping the primary steps in biological photoreceptors / Alexander Weigel. Gutachter: Nikolaus Ernsting ; Peter Hildebrandt ; Klaus Rademann

Dipl.-Chem. Alexander Weigel

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• Publié le: 01 janvier 2011
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Extrait

Femtosecond Stimulated Resonance Raman
Spectroscopy:
Towards Mapping the Primary Steps in Biological
Photoreceptors
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
(Dr. rer. nat.)
im Fach Chemie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Humboldt-Universität zu Berlin
von
Dipl.-Chem. Alexander Weigel
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Dr. Andreas Herrmann
Gutachter:
1. Prof. Dr. Nikolaus Ernsting
2. Prof. Dr. Peter Hildebrandt
3. Prof. Dr. Klaus Rademann
eingereicht am: 23. Dezember 2010
Tag der mündlichen Prüfung: 17. Februar 2011Für meine Eltern und für Alexandra.„Es gibt ein großes und doch ganz alltägliches Geheimnis.
Alle Menschen haben daran teil, jeder kennt es, aber die
wenigsten denken je darüber nach. Die meisten Leute nehmen
es einfach so hin und wundern sich kein bißchen darüber.
Dieses Geheimnis ist die Zeit.”
(Momo, Michael Ende)Abstract
Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy is a powerful tool that allows to
study the vibrational evolution of an excited chromophore directly in time. One
perspective of this method is the elucidation of structural relaxation in biological
photoreceptors. In this work the technique was built up and advanced towards
applications to flavin-based proteins.
Tunable Raman pulses were generated in a newly developed narrowband op-
tical parametric amplifier (nb-OPA). These pulses provided the basis for transient
−1Raman measurements with∼ 10 cm spectral and 50–100 fs temporal resolution.
The signal/noise ratio in these experiments allows to increase the number of tran-
sient spectra collected, by more than a factor of 10 compared to previous work.
Resonance conditions strongly affect the appearance of the stimulated Raman
spectra from an electronically excited state. The tunable Raman source was used to
explore this effect to find optimal conditions. The charactistic spectral shape under
typical resonance conditions was reproduced by simulations.
Excited-state dynamics were first investigated for the model photoswitch stil-
bene, starting from both the cis and the trans isomers. Decay, spectral shift, and
narrowing of individual bands provided insight into the vibrational relaxation of the
excited chromophore. Wavepacket motion was seen as oscillations of the Raman
bands, and evidence for anharmonic coupling between different modes was found.
Another chromophore that undergoes isomerization upon light excitation is the
“parent” cyanine, 1,1’-diethyl-2,2’-pyrido cyanine iodide (PC). For this molecule
the isomerization reaction could be followed to the ground state. From a global data
analysis Raman spectra were obtained for the Franck-Condon region, the interme-
diately populated hot ground state, and the isomerization products.
As a basis for experiments on flavoproteins the excited-state properties of the
pure flavin chromophore were studied in solution. Transient absorption and
fluorescence experiments suggest an influence of dynamic polar solvation on the
∗ ∗electronic properties of the excited state, and solvent-controled ππ -nπ coupling is
offeredasanexplanation. Ramanspectrafromtheflavinexcitedstatewererecorded
and the vibrational bands assigned. Population depletion by the Raman pulse was
identified as a potential artefact in time-dependent measurements, but the effect
was also used to mark wavepacket motion in the excited state.
The application of the developed femtosecond stimulated Raman spectrometer to
biological samples is demonstrated in a first FSRS experiment on glucose oxidase
as a model flavoprotein. Spectra from the excited state were recorded, and the
spectral evolution was followed in time. With transient absorption spectroscopy the
BlrB-L66FandSlr1694-Y8FBLUF(BlueLightUsingFAD)photoreceptormutants
were studied; signaling state formation and flavin reduction by a semiconserved
tryptophan were seen, respectively.
viiZusammenfassung
Femtosekundenaufgelöste Stimulierte Raman-Spektroskopie (FSRS) ist ein leis-
tungsfähiges Werkzeug, das es erlaubt, die Schwingungsentwicklung eines angereg-
ten Chromophors in Echtzeit zu studieren. Eine Perspektive dieser Methode ist die
Aufklärung struktureller Relaxation in biologischen Photorezeptoren. In dieser Ar-
beit wurde die Technik aufgebaut und weiterentwickelt, hin zu einer Anwendung auf
flavinbasierte Photorezeptoren.
Durchstimmbare Ramanimpulse wurden in einem neu entwickelten schmal-
bandigen optisch-parametrischen Verstärker erzeugt und bildeten die Grundlage für
−1transiente Ramanmessungen mit einer spektralen Auflösung von∼ 10 cm und
einer zeitlichen Auflösung von 50–100 fs. Das Signal/Rausch-Verhältnis in diesen
Experimenten erlaubt es, die Anzahl von Spektren in einer zeitaufgelösten Messung
um mehr als einen Faktor zehn gegenüber vorherigen Arbeiten zu erhöhen.
Die Resonanzbedingungen beeinflussen stark das Erscheinungsbild von stimu-
liertenRamanspektrenauseinemelektronischangeregtenZustand.Diedurchstimm-
bare Ramanquelle wurde dazu genutzt, diesen Effekt zu erforschen, um optimale Be-
dingungen zu finden. Die charakteristische spektrale Linienform wurde für typische
Resonanzbedingungen mit Simulationen reproduziert.
Angeregte-Zustandsdynamik wurde zuerst für den Modellphotoschalter Stilben
untersucht, ausgehend sowohl vom cis-, als auch vom trans-Isomer. Anhand der
Intensitätsabnahme des Signals sowie der spektralen Verschiebung und Bandenver-
schmälerung konnten Einblicke in die Schwingungsrelaxation des angeregten Chro-
mophors erhalten werden. Wellenpaketbewegung wurde als Oszillation der Raman-
banden beobachtet, und Anzeichen für die anharmonische Kopplung zwischen Mo-
den wurden gefunden.
Ein weiterer Chromophor, der unter Lichteinwirkung isomerisiert, ist das
„Mutter”-Cyanin 1,1’-Diethyl-2,2’-pyridocyaniniodid (PC). Für dieses Molekül
konnte die Isomierungsreaktion in den Grundzustand hinein verfolgt werden. Aus
einer globalen Datenanalyse wurden Ramanspektren des Franck-Condon-Zustandes,
des intermediär bevölkerten heissen Grundzustandes und der Isomerisierungspro-
dukte erhalten.
Als Grundlage für Experimente an Flavoproteinen wurden die Eigenschaften des
angeregten Zustandes des reinen Flavinchromophors in Lösung studiert. Tran-
siente Absorptions- und Fluoreszenzexperimente weisen auf den Einfluss von dy-
namischer polarer Solvatation auf die elektronischen Eigenschaften des angeregten
∗ ∗Zustandes hin. Lösungsmittelkontrollierte ππ -nπ -Kopplung wird als Erklärung
vorgeschlagen. Es wurden Ramanspektren des angeregten Zustandes von Flavin
aufgenommen und die Schwingungsbanden zugeordnet. Populationsverminderung
durch den Ramanimpuls wurde als potentielles Artefakt in zeitaufgelösten Messun-
gen identifiziert. Der Effekt wurde aber auch genutzt, um Wellenpaketbewegung im
angeregten Zustand zu markieren.
Die Anwendung des entwickelten femtosekundenaufgelösten stimulierten Raman-
spektrometers auf biologische Proben wurde in einem ersten FSRS-Experiment an
ixGlucose Oxidase als Modell-Flavoprotein demonstriert. Spektren vom angereg-
ten Zustand wurden aufgenommen und die spektrale Entwicklung in der Zeit ver-
folgt. Die BLUF (Blue Light Using Flavin) Photorezeptor-Mutanten BlrB-L66F
und Slr1694-Y8F wurden mit transienten Absorptionsmessungen untersucht. Dabei
wurdedieBildungdesSignalzustandesbzw.eineintermediäreReduktiondesFlavins
durch ein nahegelegenes Tryptophan beobachtet
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