Functional properties of proteins encoded by the K15 gene of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) [Elektronische Ressource] / von Melanie M. Brinkmann

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• Publié le: 01 janvier 2004
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Extrait

Functional properties of proteins encoded
by the K15 gene of the
Kaposi´s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)



Vom Fachbereich Chemie der Universität Hannover
zur Erlangung des Grades
Doktorin der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.
genehmigte Dissertation
von


Diplombiologin Melanie M. Brinkmann
geboren am 6. Januar 1974 in Neustadt am Rbg.


2004



















Refrent: Prof. Dr. W. Müler
Co-Referent: Prof. Dr. T. F. Schulz

Tag der Promotion: 18. Juni 2004
I
Zusammenfassung
Das K15 Gen des Kaposi Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) besteht aus acht
alternativ gespleissten Exons und kann potentiell für Transmembranproteine mit einer
variablen Anzahl von Membrandomänen und einem cytoplasmatischen C-Terminus kodieren.
Die C-terminale Domäne weist Bindungsmotive für Proteine mit SH2- und SH3-Domänen,
und für Tumor Nekrose Faktor Rezeptor-assoziierte Faktoren (TRAFs) auf. Diese
Eigenschaften erinnern an Transmembranproteine weiterer Vertreter der γ-Herpesviren wie
Epstein-Barr Virus, Herpesvirus saimiri, Herpesvirus ateles und Rhesus Rhadinovirus. Diese
γ-Herpesviren kodieren für Membranproteine, die intrazelluläre Signalkaskaden aktivieren
können. In dieser Arbeit wurden die vom offenen Leserahmen K15 kodierten Proteine
hinsichtlich ihrer zellulären Lokalisation und Signaleigenschaften charakterisiert. Desweiteren
wurde die in vivo Expression von K15 Proteinen in einer Reihe von KSHV-infizierten Zell-
Linien untersucht.
Es wurde gezeigt, dass ein 45 kDa K15 Protein von einem cDNA Konstrukt mit allen acht
Exons exprimiert wird, das potentiell aus bis zu zwölf Transmembrandomänen besteht.
Dieses Protein ist membranassoziiert und lokalisiert zum Teil in Membran-Mikrodomänen,
sogenannten Lipid Rafts. Unter Verwendung von dominant negativen Mutanten und
chemischen Inhibitoren wurde gezeigt, dass das 45 kDa K15 Protein den AP-1
Transkriptionsfaktor über den klassischen „Mitogen-activated protein kinase“ (MAPK)
Signalweg (Ras-Raf-MEK-Erk) aktiviert. Zusätzlich wird die Aktivität der MAP kinase JNK1
und des Transkriptionsfaktors NF- κB von K15 induziert. Die Mitglieder der Src Familie der
Protein Tyrosin Kinasen Src, Lck, Yes, Hck und Fyn interagieren mit der cytoplasmatischen
481Domäne des K15 Proteins und phosphorylieren das Y des potentiellen SH2-Bindemotives
481 481 481Y EEV. Ein K15 Expressionskonstrukt mit der Punktmutation Y zu F vermag weder
die Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF- κB, noch die MAP Kinasen Erk2 und JNK1 zu
aktivieren, was auf eine wichtige Rolle der Phosphorylierung von K15 bei der
Signaltransduktion hindeutet. Frühere Experimente zeigten, dass K15 mit TRAFs interagiert
(Glenn et al., 1999). Eine dominant negative TRAF-2 Mutante inhibiert die K15
Signaltransduktion, was auf eine Rolle von TRAF-2 bei der Signalweiterleitung von K15
hindeutet. Ferner aktiviert das 45 kDa K15 Protein den Promotor des RTA Proteins von
KSHV, und diese Aktivierung erfolgt über den Ras/MAPK Signalweg. K15 Spleissvarianten,
die Proteine mit einer geringeren Anzahl an Transmembrandomänen exprimieren, waren nicht
in der Lage, die von dem 45 kDa K15 Protein induzierten Signalwege zu aktivieren. Dies
weist auf eine wichtige Rolle der Transmembrandomänen des K15 Proteins bei der
Signaltransduktion hin. In KSHV-infizierten B Zellen wurde mit einem Antikörper gegen die
cytoplasmatische Domäne von K15 ein 23 kDa Protein detektiert. Dieses Protein war jedoch
nicht mit zellulären Membranen assoziiert. In de novo KSHV-infizierten 293-T Zellen konnte
erstmals die Expression von K15 Transkripten mittels RT-PCR nachgewiesen werden. II
Summary
The K15 gene of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus/human herpesvirus 8
(KSHV/HHV-8), encoded at the right end of the genome, consists of eight alternatively
spliced exons and is predicted to encode membrane proteins with a variable number of
transmembrane regions and a common C-terminal cytoplasmic domain with putative binding
sites for SH2- and SH3- binding domains, as well as for TRAFs. These features are
reminiscent of the viral terminal membrane proteins of other γ-herpesviruses Epstein-Barr
virus, Herpesvirus saimiri, Herpesvirus ateles and Rhesus Rhadinovirus. Their terminal
membrane proteins can activate a number of intracellular signaling pathways. The aim of this
work was to functionally characterise the proteins derived from the KSHV K15 ORF
concerning their localisation in transiently transfected cells, their ability to initiate
intracellular signaling and to analyse K15 protein expression in vivo in KSHV infected cell
lines.
A 45 kDa K15 protein derived from all eight K15 exons and containing up to 12 predicted
transmembrane domains in addition to the cytoplasmic domain was shown to be associated
with cellular membranes and to localise to lipid rafts. As shown with dominant negative
mutants and chemical inhibitors, this K15 protein activated the AP-1 transcription factor via
the classical Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) pathway Ras-Raf-MEK-Erk2 and the
MAPK JNK1. Furthermore, the eight exon K15 protein activated the transcription factor NF-
κB. Members of the Src family of non-receptor protein tyrosine kinases (PTK) Src, Lck, Yes,
Hck and Fyn were shown to bind to the cytoplasmic C-terminal domain of K15 and to
481phosphorylate the tyrosine residue in the putative SH2-binding motif Y EEV. A K15
481 481construct carrying the point mutation Y to F was unable to activate the transcription
factors AP-1 and NF- κB, pointing to a role of tyrosine phosphorylation by PTKs in K15
signaling. Earlier experiments showed that TRAFs-1, -2 and -3 bind to the cytoplasmic
domain of K15. A dominant negative TRAF-2 mutant inhibited the K15-mediated activation
of the Ras/MAPK pathway, suggesting an involvement of TRAF-2 in the inititation of these
signaling routes. Furthermore, the eight exon K15 protein was shown to activate the promoter
of the KSHV gene ORF50/Rta, and this involved the Ras/MAPK pathway and TRAF-2. In
addition to the eight exon K15 isoform, several splice variants are derived from the K15 ORF
that are predicted to encode proteins with fewer transmembrane domains. These K15 splice
variants, although containing the intact cytoplasmic domain like the 45 kDa K15 protein,
activated the MAPK and NF- κB pathways only weakly. Therefore, the transmembrane region
of K15 seems to be important for efficient signaling.
In B-cells naturally infected with KSHV, a 23 kDa protein was detected with K15
antiserum. However, unlike an experimentally generated K15 variant of this size, this protein
was not associated with cellular membranes. K15 transcripts were also identified by RT-PCR
in de novo KSHV-infected HEK 293-T cells one day post infection. III
Keywords/Schlagworte
English:
Kaposi´s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)
K15
Signaling
Deutsch:
Kaposi Sarkom-assoziiertes Herpesvirus (KSHV)
K15
Signaltransduktion
IV
List of contents

Zusammenfassung I
Sumary I
Keywords/Schlagworte III
List of contents IV
List of abbrevations VII


1 Introduction 1
1.1 The Family Herpesviridae 1
1.2 The Kaposi´s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) 2
1.3 Signaling activity of terminal membrane proteins of γ-herpesviridae:
common strategies and differences 13

1.3.1 Epstein-Barr virus (EBV) and latent membrane proteins LMP1 and LMP2A 14
1.3.1.1 LMP1 15
1.3.1.2 LMP2A 23
1.3.2 R1 and R15 of Rhesus rhadinovirus (RRV) 28
1.3.3 Saimiri transforming protein (Stp) and tyrosine kinase interacting protein
(Tip) of Herpesvirus saimiri (HVS) 30
1.3.4 The Herpesvirus ateles (HVA) two-in-one (Tio) protein 36
1.3.5 The KSHV K1 protein 37
1.3.6 The K15 open reading frame of KSHV 42

1.4 Objectives 50

2 Material and Methods 51
2.1 Reagents Chemicals 51
2.1.1 Antibodies 51
2.2 Vectors and Primers 52
2.2.1 Eucaryotic expression vectors 52
2.2.2 Reporter vectors 58
2.2.3 Procaryotic vectors 58
2.2.4 Primers 59
2.3 Eucaryotic cell culture methods 60
2.3.1 General components for cell culture 60
2.3.2 Eucaryotic cell lines 60 V
2.3.3 Cell culture conditions 62
2.3.4 Cryoconservation 63
2.3.5 Lytic cycle induction, preparation of rKSHV.219 and infection of
epithelial and B-cells with rKSHV.219 63
2.3.6 Production of Baculovirus ORF50/RTA
2.3.7 Transient transfection 64
2.3.8 Generation of mouse monoclonal antibodies to the
C-terminal K15 domain 64
2.4 Procaryotic culture methods 65
2.4.1 Culture media and growth conditions 65
2.4.2 Bacterial strains
2.4.3 Cryoconser