Genetic and biochemical characterisation of Arabidopsis thaliana pantothenate synthetase [Elektronische Ressource] / Rafał Kazimierz Jończyk

Rafal Kazimierz Jonczyk

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 49
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

Lehrstuhl für Genetik der
Technischen Universität München


Genetic and biochemical characterisation of
Arabidopsis thaliana pantothenate synthetase



Rafał Kazimierz Jończyk


Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung
des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

genehmigten Dissertation.


Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Kay H. Schneitz
Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. Alfons Gierl
2. Univ.-Prof. Dr. Gert Forkmann
3. Univ.-Prof. Dr. Wilfried Schwab


Die Dissertation wurde am 31. 01. 2007 bei der Technische Universität München eingereicht
und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung
und Umwelt am 26. 04. 2007 angenommen.


Zusammenfassung
Zusammenfassung

Pantothenat (Vitamin B ) ist der universelle Vorläufer von Coenzym A, das essentielle 5
Funktionen im Metabolismus von Kohlenhydraten und Fettsäuren erfüllt. Die Biosynthese
von Pantothenat ist auf Pflanzen, Pilze und Mikroorganismen beschränkt, während Tiere das
Vitamin mit der Nahrung aufnehmen müssen. Daher sind die Enzyme dieses Synthesewegs
interessant als potentielle Targets für neuartige Herbizide, Fungizide und antimikrobielle
Wirkstoffe. Darüber hinaus wird die Pantothenatbiosynthese mit dem Ziel bearbeitet, das
Vitamin in Mikroorganismen zu produzieren und Pflanzen mit erhöhtem Vitamin B -Gehalt 5
zu erzeugen.
Die Biochemie, der Mechanismus und die Regulation der Biosynthese von Pantothenat
sind in Mikroorganismen ausführlich untersucht worden, aber das Verständnis dieses
Synthesewegs in Pflanzen ist weiterhin unvollständig. In Arabidopsis thaliana wird
Pantothenat durch das cytosolische Enzym Pantothenat Synthetase (PTS) synthetisiert, das
von einem einzigen Gen (PTS) kodiert wird. Es gibt Hinweise, dass Pflanzen über einen
weiteren, PTS-unabhängigen Syntheseweg für Pantothenat verfügen, der über Pantoyllacton
anstelle von Pantoat verläuft. Um die physiologische Rolle von PTS in Arabidopsis näher zu
bestimmen, wurden in dieser Arbeit zunächst zwei T-DNA Insertionsmutanten charakterisiert.
Beide Insertionsallele von PTS verursachten einen rezessiven, Embryo-lethalen Phänotyp.
Normale Samenentwicklung und der übrige Lebenszyklus von pts Mutanten konnten
entweder durch Zugabe von exogenem Pantothenat oder durch Transformation mit dem E.
coli Gen für PTS wiederhergestellt werden. Diese Ergebnisse weisen stark darauf hin, dass die
alleinige Rolle von Arabidopsis PTS in der Synthese von Pantothenat besteht und dass kein
weiteres Enzym in der Lage ist, das Vitamin in ausreichender Menge bereitzustellen. Durch
konstitutive, cytosolische Überexpression von E. coli PTS in Arabidopsis konnte die aus
Blattgewebe extrahierbare PTS-Aktivität gegenüber Wildtypkontrollen um das bis zu 660-
fache erhöht werden. Damit war jedoch keine signifikante Änderung des Pantothenat-Gehalts
in Blättern verbunden. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die PTS Aktivität in Arabidopsis nicht
limitierend für die Produktion von Pantothenat ist. PTS-Promotor::β-glucoronidase Studien
und die Analyse von öffentlichen Microarraydaten zeigten, dass das PTS Gen in Arabidopsis
ubiquitär exprimiert wird, was der fundamentalen Funktion dieses Gens entspricht.
Die Biosynthese von Pantothenat in Pflanzen ähnelt dem entsprechenden Prozess in
Bakterien, aber es gibt wichtige Unterschiede sowohl bei den beteiligten Enzymen als auch in
i Zusammenfassung
der subzellulären Organisation. Im Gegensatz zu bakteriellen PTS zeigen pflanzliche PTS
starke Substratinhibierung durch Pantoat, und dieses Phänomen wurde bisher als Teil eines
regulatorischen Mechanismus für Pantothenat in Pflanzen diskutiert. Um die strukturelle
Basis und die physiologische Relevanz der Substratinhibierung in pflanzlichen PTS
aufzuklären, wurden detaillierte enzymkinetische Untersuchungen mit PTS aus Arabidopsis
und E. coli durchgeführt. Zunächst wurde gezeigt, dass Arabidopsis PTS ein homodimeres
Enzym ist, das demselben zweischrittigen Reaktionsmechanismus folgt, der für E. coli PTS
bereits etabliert ist. Außerdem besaßen Arabidopsis und E. coli PTS nahezu identische pH-
Profile für die Pantothenatsynthese (Vorwärtsreaktion) und die Pantothenat:β-Alanin
Austauschreaktion, was nahe legt, dass konservierte Aminosäurereste im aktiven Zentrum an
den geschwindigkeitsbestimmenden Schritten dieser Prozesse beteiligt sind. Ein Alignment
der verfügbaren PTS Aminosäuresequenzen bestätigte, dass die bekannten Reste im aktiven
Zentrum von bakteriellen PTS in der gesamten Proteinfamilie konserviert sind. Das
Alignment zeigte außerdem eine besondere Dimerisierungsdomäne in PTS aus grünen
Pflanzen, die, verglichen mit PTS aus Bakterien oder Pilzen, durch eine Insertion von ca. 20
Aminosäureresten gekennzeichnet ist. Enzymkinetische Untersuchungen von wildtypischen
und mutanten Formen der PTS aus Arabidopsis zeigten, dass die Pflanzen-spezifische
Dimerisierungsdomäne allosterische Wechselwirkungen der beiden Untereinheiten vermittelt,
die Substratinhibierung und andere nicht-hyperbole kinetische Eigenschaften zur Folge haben.
Die kinetischen Eigenschaften von Arabidopsis PTS ergeben keinen Hinweis auf eine
biochemische Regulation dieses Reaktionsschritts im Syntheseweg von Pantothenat.
Allerdings wurde gezeigt, dass der allosterische Mechanismus zu erhöhter katalytischer
Effizienz bei niedrigen Pantoat- und β-Alaninkonzentrationen führt, und zwar auf Kosten von
verringerter katalytischer Effizienz bei hohen Pantoat- und β-Alaninkonzentrationen. Dieses
Ergebnis legt nahe, dass Allosterie in pflanzlichen PTS evolviert ist, um eine Feinabstimmung
des Enzyms auf niedrige Substratkonzentrationen zu erreichen.
Aufgrund der vorliegenden Arbeit kann ein verbessertes Modell der
Pantothenatbiosynthese in Pflanzen vorgeschlagen werden, in dem die Rate der
Pantothenatproduktion durch die Verfügbarkeit von Pantoat oder β-Alanin im Cytosol, aber
nicht durch PTS Aktivität limitiert wird. In diesem Modell haben die spezifischen
katalytischen Eigenschaften von pflanzlichen PTS keinerlei regulatorische Funktion, sondern
erlauben eine robuste Synthese von Pantothenat bei niedrigen Gehalten an Pantoat und β-
Alanin. Eine niedrige cytosolische Konzentration von Pantoat würde außerdem bedeuten, dass
ii Zusammenfassung
Substratinhibierung, also die auffälligste kinetische Eigenschaft von pflanzlichen PTS in
vitro, keinerlei Bedeutung in vivo hätte. Schließlich besagt dieses Modell der
Pantothenatbiosynthese, dass PTS kein geeignetes Target für die Erhöhung des Vitamin B -5
Gehalts in Pflanzen ist.


iii Summary
Summary

Pantothenate (vitamin B ) is the precursor to coenzyme A, an essential cofactor that is 5
required in the metabolism of carbohydrates and fatty acids. As a vitamin, the pathway of its
synthesis is confined to plants, fungi, and microorganisms, and animals must obtain it in their
diet. Consequently, the enzymes of the pathway are potential targets for novel drugs including
herbicides, fungicides, and antimicrobial agents. Furthermore, there is an interest in
developing a biotransformation system for the production of pantothenate by microorganisms
and to enhance the vitamin B content of plants. 5
The biochemistry, mechanism and regulation of the biosynthetic pathway of pantothenate
have been thoroughly characterized in microorganisms, but our knowledge of this pathway in
plants remains fragmented. In Arabidopsis thaliana, pantothenate is synthesised by the
cytosolic enzyme pantothenate synthetase (PTS) which is encoded by a single gene (PTS). It
is unclear whether PTS represents the only mode of pantothenate production in plants as two
previous reports pointed to the existence of a parallel pathway that proceeds via pantoyl
lactone instead of pantoate. To asses the role of PTS in Arabidopsis, two T-DNA insertion
mutants were characterized. Both mutant alleles of Arabidopsis PTS conferred a recessive
embryo-lethal phenotype. Normal seed development and the remaining life cycle could be
restored in pts mutants either by supplying exogenous pantothenate or by introducing a T-
DNA carrying the E. coli gene for PTS. This is strong evidence that the sole role of PTS in
Arabidopsis is to synthesize pantothenate and that no other enzyme can produce sufficient
amounts of the vitamin. Constitutive overexpression of E. coli PTS in the cytosol caused the
extractable PTS activity in transgenic Arabidopsis leaves to increase by up to 660-fold, but
this had no effect on the steady-state levels of pantothenate. This suggests that PTS activity is
not limiting for the synthesis of pantothenate in Arabidopsis. PTS-promoter::β-glucoronidase
reporter activity and analysis