High cell-density fermentations of recombinant microorganisms using a pressurized, pilot-scale bioreactor [Elektronische Ressource] / Ingo Knabben

Ingo Knabben

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• Publié par: rheinisch-westfalischen_technischen_hochschule_-rwth-_aachen
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 40
• Langue: Deutsch
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Extrait

High cell-density fermentations of
recombinant microorganisms using a
pressurized, pilot-scale bioreactor




Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der
RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigte Dissertation vorgelegt von


Dipl.-Ing. (FH)

Ingo Knabben


geboren in Köln am Rhein,
aus Bedburg-Kaster, Rhein-Erft Kreis, Nordrhein-Westfalen.


Berichter: Universitätsprofessor Dr.-Ing. Jochen Büchs
Universitätsprofessor Dr.rer.nat Lothar Elling

Tag der mündlichen Prüfung: Montag, den 29. November 2010

Diese Dissertation ist auf der Internetseite der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Page 2

Die vorliegende Arbeit entstand während meiner Tätigkeit am Lehrstuhl für
Bioverfahrenstechnik der Rheinisch Westfälichen Technischen Hochschule Aachen.

Allen, die zum Gelingen dieser Arbeit begetragen haben, danke ich sehr herzlich. Mein
besonderer Dank gilt dabei:

meinem Doktorvater, Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. Jochen Büchs für die Möglichkeit der
Promotion an seinem Lehrstuhl, für die fachliche Betreuung und den großen Freiraum
bei der Gestaltung, Durchführung und Erstellung der Arbeit,

Herrn Univ.-Prof. Dr.rer.nat Lothar Elling für die freundliche Übernahme des
Koreferates, Herrn Univ.-Prof. Dr.rer.nat Johannes Bohrmann für die freundliche
Übernahme des Prüfungsvorsitzes und Herrn Univ.-Prof. Dr.rer.nat Ulrich Schwaneberg
für die freundliche Übernahme der Funktion als Drittprüfer,

allen Kollegen des Lehrstuhls, hier insbesondere Herrn Dipl.-Ing. Lars Regestein für die
fruchtbaren Diskussionen und die Hilfe während der Durchführung der Fermentation
und der Durchsicht der schriftlichen Arbeit,

allen Studenten, die mit Ihrer Arbeit zum Gelingen meiner Promotion beigetragen
haben, dabei besonders den Studenten, die ich in ihrer Abschlussarbeit betreuen durfte,
namentlich Frau Dipl.-Ing. Esther Gartz, Herrn Dipl.-Ing. (FH) Jamalledine Sassi, Herrn
Dipl.-Ing. (FH) Carsten Grumbach, Herrn Dipl.-Ing. (FH) Frank Marquering und Frau
B.Sc. Julia Fritsch, geb. Schauf,

den Mitarbeitern des Lehrstuhls aus Labor und Werkstatt, die durch ihren Einsatz und
ihre Kooperationsbereitschaft stets eine große Hilfe waren,

meiner Frau Nadine, meinen Eltern und meiner Familie, die mir auch in schwierigen
Situationen immer Kraft, Mut und Liebe geschenkt haben. Ohne euch wäre das Alles
für mich nicht möglich gewesen. Danke!




Page 3

„Es ist wichtig,
dass ihr alle leidenschaftlich
nach der Wahrheit sucht und
zu ihren unerschrockenen Zeugen werdet.
Ihr dürft euch nie mit Lüge,
Falschheit oder Kompromissen abfinden!
Setzt euch heftig gegen die Leute zur Wehr,
die eure Intelligenz einfangen wollen
oder euer Herz mit Aussagen
und Vorschlägen umgarnen
und euch hörig machen wollen.
Sie drängen euch in die Leere
der Einsamkeit und führen euch
in das Labyrinth einer Kultur des Todes.“

Papst Johannes Paul II.











Page 4

Abstract


As industrial fermentation processes mostly focus on producing high target
concentrations of biocatalysts or pharmaceutical ingredients, it is important to
investigate cell growth under high cell-density conditions. Thus, in this work different
recombinant microorganisms (bacteria and yeast strains) were basically cultivated in a
pressurized, pilot-scale bioreactor to high cell density. Focussing on high biomass
concentrations, empirical (batch mode and fed-batch mode) and model-based process
strategies (fed-batch mode) were investigated. Furthermore, in one case product
concentration (pDNA-vaccine) conducted under pressurized conditions was directly
compared to a non-pressurized process strategy (using oxygen-enriched air). Moreover,
the highest ever shown process values for conventional online measurement techniques
(capacitance and respiration activity) could be pointed out, validating viability of the
microbial cultures during aerobic bioprocesses. Here, linear biomass / capacitance
-1correlations up to biomass concentrations of 180 gL and oxygen transfer rates up to 1
-1 -1molL h were reached. For batch and fed-batch processes it could be shown that
increasing the head-space pressure in stirred bioreactors can be a practicable approach
to provide the oxygen demand of extremely high cell-density cultures. Consequently,
for reaching unusual high amounts of biomass or product, process strategies for high
cell-density under increased head-space pressure could lead to a minimized bioreactor
capacity utilization or minimized bioreactor size.










Page 5

Kurzfassung


Da die meisten industriellen Fermentationsprozesse heutzutage darauf fockussieren,
hohe Endkonzentrationen an Biokatalysatoren oder pharmazeutischen Wirkstoffen zu
erreichen, ist es von entscheidender Bedeutung mikrobielles Wachstum unter dem
Gesichtspunkt der Hochzelldichte zu untersuchen. Aus diesem Grund werden in der
vorliegenden Arbeit verschiedene Versuche mit rekombinanten Mikroorganismen
(Bakterien und Hefen) vorgestellt, die grundsätzlich alle in einem mit bis zu 10 bar
Überdruck beaufschlagbaren Pilot-Bioreaktor durchgeführt wurden. Mit dem Ziel hohe
Biomassekonzentrationen zu erreichen, wurden sowohl empirische Daten in Form von
Batch- und Fed-Batch-Fermentationen als auch modell-gestützte Fed-Batch-
Versuchsreihen untersucht. Desweiteren wurden Produktkonzentrationsverläufe
(pDNA-Vakzin) aus Hochzelldichte-Fermentationen verglichen, die einerseits mit
erhöhtem Reaktorkopfdruck und andereseits drucklos mit Sauerstoff angereicheter
Zuluft erreicht wurden. Parallel zu diesen Fermentationsergebnissen konnten die bisher
höchsten Werte mit konventioneller, Online-Messtechnik (Kapazität und
Atmungsaktivität) generiert werden, die gleichzeitig für den Nachweis einer jeweilig
viabilen, mikrobiellen Kultur im laufenden Bioprozess herangezogen werden konnten.
Konkret konnten hier lineare Korrelationen zwischen Biomasse und Kapazität bis zu
-1 -1 -1einer Biotrockenmasse von 180 gL und Sauerstofftransferraten von bis zu 1 molL h
aufgezeigt werden. Weiterhin konnte in dieser Arbeit herausgearbeitet werden, dass der
Sauerstoffbedarf von extremen Hochzelldichte-Fermentationen sowohl in Batch- als
auch in Fed-Batch-Prozessen mit einem stetigen Steigern des Reaktorkopfdrucks bis zu
10 bar Überdruck in einem gerührten Bioreaktor gedeckt werden kann. Deshalb kann
diese Prozessstrategie zukünftig dazu führen, unüblich hohe Konzentrationen an
Biomasse und / oder –produkt zu erreichen, was wiederum zu einer verringerten
Bioreaktorauslastung und / oder zu einer verringerten Bioreaktorgröße führen könnte.





Page 6

Directory

Abstract, E nglish 4

Kurzfassung, Deutsch 5

Figures 11

Tables 16

Nomeclature 17

Introduction 19

1 High cell-density processes in batch mode of a
genetically engineered Escherichia coli strain with
minimized overflow metabolism using a pressurized
bioreactor
22

1.1 Introduction.......................................................................................22
1.2 Material and Methods .......................................................................24
1.2.1 Microbial strains....................................................................24
1.2.2 Culture media........................................................................24
1.2.3 Cultivation.............................................................................25
1.2.4 Analytical methods................................................................26
1.2.4.1 Offline-detection of biomass concentration.............26
1.2.4.2 O and CO measurement in the offgas for the 2 2
calculation of OTR...................................................27
1.2.4.3 Offline glucose concentration...................................27 <