High-throughput metabolome analysis of transposon mutants of Corynebacterium glutamicum and quenching of microbial metabolism [Elektronische Ressource] / von Jana Spura
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TECHNISCHE UNIVERSITÄT CAROLO-WILHELMINA ZU BRAUNSCHWEIGHigh-throughput metabolome analysis of transposonmutants of Corynebacterium glutamicum and quenching of microbial metabolismVon der Fakultät für Lebenswissenschaftender Technischen Universität Carolo-Wilhelminazu Braunschweigzur Erlangung des Grades einerDoktorin der Naturwissenschaften(Dr. rer. nat.)genehmigteD i s s e r t a t i o nvon Jana Spuraaus Torgau1. Referentin oder Referent: Professor Dr. Dietmar Schomburg2. Referentin oder Referent: Professor Dr. Dieter Jahneingereicht am: 15.12.2008mündliche Prüfung (Disputation) am: 24.02.2009Druckjahr 2009Vorveröffentlichungen der DissertationTeilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Fakultät fürLebenswissenschaften, vertreten durch den Mentor der Arbeit, in folgendenBeiträgen vorab veröffentlicht:PublikationenBörner, J., Buchinger, S. & Schomburg, D. A high-throughput method for microbialmetabolome analysis using gas chromatography/mass spectrometry. AnalyticalBiochemistry 367: 143-151 (2007)Spura, J. & Schomburg D. Hochdurchsatzmetabolomanalyse von Mikro-organismen. Laborwelt 6: 21-24 (2008)TagungsbeiträgeBörner, J., Buchinger, S. & Schomburg, D. High-throughput method for microbialmetabolome analysis. (Poster) European BioPerspectives, Köln (2007).Börner, J., Buchinger, S. & Schomburg, D. High-throughput method for microbialmetabolome analysis. (Poster) ProkaGENOMICS, Göttingen (2007).Spura, J., Reimer, L., Lühr, T.

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Publié le 01 janvier 2009
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TECHNISCHE UNIVERSITÄT
CAROLO-WILHELMINA
ZU BRAUNSCHWEIG
High-throughput metabolome analysis of transposon
mutants of Corynebacterium glutamicum and
quenching of microbial metabolism
Von der Fakultät für Lebenswissenschaften
der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina
zu Braunschweig
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
genehmigte
D i s s e r t a t i o n
von Jana Spura
aus Torgau1. Referentin oder Referent: Professor Dr. Dietmar Schomburg
2. Referentin oder Referent: Professor Dr. Dieter Jahn
eingereicht am: 15.12.2008
mündliche Prüfung (Disputation) am: 24.02.2009
Druckjahr 2009Vorveröffentlichungen der Dissertation
Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Fakultät für
Lebenswissenschaften, vertreten durch den Mentor der Arbeit, in folgenden
Beiträgen vorab veröffentlicht:
Publikationen
Börner, J., Buchinger, S. & Schomburg, D. A high-throughput method for microbial
metabolome analysis using gas chromatography/mass spectrometry. Analytical
Biochemistry 367: 143-151 (2007)
Spura, J. & Schomburg D. Hochdurchsatzmetabolomanalyse von Mikro-
organismen. Laborwelt 6: 21-24 (2008)
Tagungsbeiträge
Börner, J., Buchinger, S. & Schomburg, D. High-throughput method for microbial
metabolome analysis. (Poster) European BioPerspectives, Köln (2007).
Börner, J., Buchinger, S. & Schomburg, D. High-throughput method for microbial
metabolome analysis. (Poster) ProkaGENOMICS, Göttingen (2007).
Spura, J., Reimer, L., Lühr, T. & Schomburg, D. Screening of transposon mutants
of Corynebacterium glutamicum using a high-throughput method for microbial
metabolome analysis. (Vortrag) European BioPerspectives, Hannover (2008).
Reimer, L., Spura, J., Wieloch, P., Schreiber, K. & Schomburg, D Quenching of
different microorganisms for metabolome analysis using an ethanol/sodium
chloride-quenchingsolution (Poster) European BioPerspectives, Hannover (2008). Table of contents I
Table of contents
Abstract.................................................................................................................................III
Kurzzusammenfassung.........................................................................................................IV
Abbreviations & Formula......................................................................................................V
1 Introduction.....................................................................................................................1
1.1 Systems biology.........................................................................................................1
1.1.1 Genomics............................................................................................................1
1.1.2 Transcriptomics..................................................................................................2
1.1.3 Proteomics..........................................................................................................2
1.1.4 Metabolomics.....................................................................................................3
1.2 Metabolomics in functional genomics.......................................................................3
1.2.1 Methods in metabolome analysis.......................................................................4
1.2.2 Pre-analytical sample preparation for metabolome analysis with
Gas Chromatography/Mass Spectrometry.......................................................15
1.2.3 High-throughput performances in metabolome analysis.................................19
1.2.4 Transposon mutagenesis and the construction of a mutant bank.....................19
1.3 Model organisms......................................................................................................21
1.3.1 Corynebacterium glutamicum..........................................................................21
1.3.2 Escherichia coli................................................................................................23
1.3.3 Saccharomyces cerevisiae................................................................................24
1.4 Thesis aims...............................................................................................................26
2 Material & Methods......................................................................................................27
2.1 Used chemicals and machines.................................................................................27
2.2 Software and libraries..............................................................................................31
2.3 Used bacteria strains................................................................................................33
2.4 Applied kits..............................................................................................................33
2.5 Statistic and calculation of errors.............................................................................34
2.6 Media, buffer and solutions.....................................................................................35
2.7 Standard metabolome analysis ................................................................................46
2.7.1 Cultivation in shaking flasks............................................................................46
2.7.2 Pre-analytical sample preparation....................................................................47II Table of contents
2.7.3 GC/MS analysis and data processing...............................................................49
2.8 High-throughput metabolome analysis....................................................................50
2.8.1 Cultivation in micro titer plates........................................................................50
2.8.2 Semi-automatic sample preparation.................................................................51
2.8.3 GC/MS analysis and data processing...............................................................53
2.9 Quenching of microorganisms.........53
2.9.1 Ethanol quenching (EQ)...................................................................................55
2.9.2 Methanol quenching (MQ)...............................................................................56
2.9.3 Cold glycerol saline quenching (GSQ)............................................................56
2.10 Plasmid rescue technique.......57
3 Results & Discussion.....................................................................................................62
3.1 Development of a high-throughput method for metabolome analysis....................62
3.1.1 Method development........................................................................................62
3.1.2 Method evaluation............................................................................................72
3.2 Screening of transposon mutants.............................................................................75
3.2.1 Growth of analyzed transposon mutants..........................................................75
3.2.2 Development of suitable screening criteria......................................................77
3.2.3 Hierarchical clustering of the growth-deficient mutants..................................92
3.2.4 Investigation of changes in metabolite levels..................................................94
3.2.5 Identification of the transposon insertion site of some mutants.......................97
3.3 Comparison of different quenching methods.........................................................101
3.3.1 Refinement of the ethanol quenching method...............................................101
3.3.2 Difficulties in the cold glycerol saline quenching performance....................106
3.3.3 Quenching of Escherichia coli.......................................................................107
3.3.4 Quenching of Corynebacterium glutamicum.................................................116
3.3.5 Quenching of Saccharomyces cerevisiae.......................................................123
4 Summary......................................................................................................................130
5 Outlook.........................................................................................................................132
6 References.....................................................................................................................133
7 Appendix.......................................................................................................................142 Abstract III
Abstract
A suitable method is the prerequisite for comprehensive screening performances.
Therefore, an analytical method for high-throughput metabolome analysis on basis of our
well established standard method was developed. Fast metabolome analysis was done
using gas chromatography/mass spectrometry. Two major advantages were parallelization
of operations and partial automation. In short this means a clear reduction of time needed
for the pre-analytical steps. The standard error between independent samples of the model
organism Corynebacterium glutamicum raised on the same plate was decreased to 13%.
Additionally, the runtime of a single measurement was decreased, allowing an increased
number of measurements per day. The adaptation of our internal standard library achieved
650 quantifiable peaks per single GC/MS run.
With this method around 320 transposon mutants of Corynebacterium glutamicum were
investigated, and suitable screening criteria were developed to identify mutants with
significant changes of their phenotype. First indicators regarding this research came from a
comparison of mutant and wild type raised on the same plate. But for a clear differentiation
of changes caused by gene deletion and those resulting from biological and environmental
variations, a wild type reference list was created. A threshold for each metabolite was
calculated revealing significant differences.
The last part of this thesis deals with the development of a quenching method applicable
for different microorganisms. An ethanol quenching procedure, established earlier in our
group, was optimized, and evaluated against results coming from published quenching tests
for three different organisms: Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli and
Saccharomyces cerevisiae. The ethanol quenching method in most cases produced the
highest number of detected metabolites, and had a low standard error. Also, this samples
showed the highest range of relative concentrations of identified metabolites.IV Kurzzusammenfassung
Kurzzusammenfassung
Ein umfassendes und erfolgreiches Screening ist nur mit einer geeigneten Methode
möglich. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Hochdurchsatzmethode zur
Metabolomanalyse entwickelt. Grundlage war die Standardmethode unserer Arbeitsgruppe.
Die Metabolomanalyse wurde unter Verwendung der Gaschromatographie/Massen-
spektrometrie durchgeführt. Hauptvorteile waren Parallelisierung und Teilautomatisierung,
die zu einer Verringerung der benötigten Zeit für die Probenvorbereitung führten. Der
Standardfehler unabhängiger Proben des Modellorganismus Corynebacterium glutamicum
wurde auf 13% reduziert. Außerdem wurde die Laufzeit einer Messung verkürzt und so die
Anzahl pro Tag erhöht. Die Anpassung unserer internen Standardbibliothek führte zu 650
quantifizierbaren Peaks je GC/MS-Lauf.
Diese Methode wurde verwendet, um zirka 320 Transposonmutanten von
Corynebacterium glutamicum zu untersuchen und geeignete Kriterien für das Screening
nach Mutanten mit signifikanten Veränderungen des Phänotyps zu entwickeln. Zuerst
erfolgte der direkte Vergleich gemeinsam kultivierter Mutanten- und Wildtypproben.
Allerdings konnte nicht zwischen Veränderungen durch Gendeletion und biologischen und
umweltbedingten Schwankungen unterschieden werden. Deshalb wurde eine Referenzliste
erstellt. Die Ermittlung eines für jeden Metaboliten spezifischen Schwellenwerts ließ
signifikante Veränderungen erkennen.
Im letzten Teil der Arbeit wurde eine Quenchingmethode für unterschiedliche Mikro-
organismen untersucht. Dafür wurde eine bereits vorhandene Ethanolquenchmethode
unserer Arbeitsgruppe optimiert und an verschiedenen Organismen - Corynebacterium
glutamicum, Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae - sowie im direkten Vergleich
zu publizierten Methoden evaluiert. Das Quenchen mit Ethanol lieferte in den meisten
Fällen die höchste Anzahl sowie die höchsten relativen Konzentrationen identifizierter
Metabolite verbunden mit geringen Standardfehlern. Abbreviations & Formula V
Abbreviations & Formula
2D-PAGE two-dimensional polyacrylamid gel electrophoresis
A diffusion influenced by packing of the column
Abs. absolute
ADC analog to digital conversion
AMDIS Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System
AMP Adenosine-5'-monophosphate
APCI atmospheric pressure chemical ionization
B longitudinal diffusion
B2P6 bank 2 plate 6
BHI brain heart infusion medium (complex medium)
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
bp base pair(s)
BRENDA Braunschweiger Enzymdatenbank (Braunschweig enzyme database)
BSA N,O-bis(trimethylsilyl)acetamid
BSTFA N,O-bis(trimethylsilyl)trifuoracetamid
b width in half height of the peak 0.5
C term for reaching the equilibrium
CDW cell dry weight
CE capillary electrophoresis
C. glutamicum Corynebacterium glutamicum
CI chemical ionization
Δ delta, difference
DB-5MS chromatographic column, fused silica
DNA deoxyribonucleic acid
e unit charge
eV electron voltage
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EI electron ionization, electron impact ionization
E kinetic energykinVI Abbreviations & Formula
Error standard error of a metabolite from the wild type reference listRef
ESI electrospray ionization
ESOMs emergent self organizing maps
EQ ethanol quenching
g acceleration of gravity
GC gas chromatography, gas chromatograph
GC-GC tandem gas chromatography
GSQ cold glycerin saline quenching
h hour
H height of effective theoretical plateseff
i control variable
IS6100 insertion sequence 6100
K distribution coefficientD
RKan kanamycin resistance marker
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
L length of GC column in mm
l length of the flight tube
LB Luria-Bertani medium
LC liquid chromatography
m ion mass
Mb mega bases
ml, l milliliter, liter
mm millimeter
MM1 minimal medium
MALDI matrix assisted laser desorption ionization
MCP micro channel plate
mM milli-molar
mRNA messenger ribonucleic acid
MS mass spectrometry, mass spectrometer
MS/MS tandem mass spectrometry
MSTFA N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamid
MT relative concentration of metabolite in mutant sample