Identification and characterization of the ion channel TRPM8 in prostate cancer [Elektronische Ressource] / Simone Kaiser

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• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2004
• Nombre de lectures: 104
• Langue: Deutsch
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Extrait

Identification and Characterization of the Ion Channel
TRPM8 in Prostate Cancer
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
Simone Kaiser
geboren am 10.10.1973 in Berlin
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter: 1. Prof. Dr. Thomas Börner
2. Prof. Dr. Matthias Dürst
3. PD Dr. Wolfgang Kemmner

Eingereicht am: 30.12.2003
Tag der mündlichen Prüfung: 10.06.2004

Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes. Bei den zu
Tode führenden Tumoren wird es im Jahre 2003 nach dem Bronchialkarzinom
an 2. Stelle stehen. Diese Inzidenz zeigt, dass dringend neue diagnostische
Marker und therapeutische Zielgene zur Behandlung von Prostatakrebs benötigt
werden.
Ziel dieser Dissertation war es, mit Hilfe der DNA-Chiptechnologie neue
tumorrelevante Gene für eine Small-Molecule- und Antikörper-Basierte Therapie
des Prostatakarzinoms zu identifizieren. Auf einen proprietären Tumor-Chip der
Firma metaGen Pharmaceuticals GmbH wurde mikrodissektiertes Normal- und
korrespondierendes Tumorgewebe von 52 Prostatatumorpatienten hybridisiert.
Mit Hilfe bioinformatischer Analysen der Chipergebnisse konnte das Gen
TRPM8 identifiziert werden, das in Prostatatumoren in mehr als 56% der
Patienten überexprimiert ist.
Northern-Blot, Dot-Blot und Chipexperimente zeigten, dass TRPM8 unge-
wöhnlich gewebespezifisch exprimiert wird. In mehr als 400 getesteten Tumor-
patienten und in 23 Normalgeweben wurde TRPM8 ausschließlich in der
Prostata und neuroendokrinen Tumoren nachgewiesen.
TRPM8 gehört zur Familie der Transient Receptor Potential Channel Proteins.
Es konnte hier erstmals in Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer- Experi-
menten (FRET) gezeigt werden, dass TRPM8 Multi-Homomere bildet. Dies
wurde bisher nur für Kanäle anderer TRP-Subfamilien (TRPV und TRPC)
gezeigt.
Weiterhin konnten erstmals mehrere Spleißvarianten von TRPM8 identifiziert
werden. Quantitative RT-PCR Experimente zeigten, dass diese noch stärker in
Prostatatumoren überexprimiert sind als TRPM8 selbst. Des Weiteren wurde ein
neues Gen auf dem DNA-Gegenstrang von TRPM8 entdeckt, das mit Exon 11
von TRPM8 100% komplementär ist und an der Regulation von TRPM8
beteiligt sein könnte.
Der Promotor von TRPM8 wurde durch eine in silico Analyse identifiziert und
in vitro bestätigt. Obwohl eine starke androgenabhängige Expression von
TRPM8 in LNCaP Zellen gezeigt werden konnte, wurden keine Bindungsstellen
für androgenabhänginge Elemente gefunden. Allerdings ließen sich drei Bin-
dungsstellen des androgenregulierten Homeoboxgens NKX3.1 identifizieren.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass TRPM8 und seine Isoformen aufgrund
ihrer Gewebspezifität ausgezeichnete Angriffspunkte für eine zielgerichtete
Prostatakrebstherapie sind.
TRPM8
Prostata
Krebs
Chip
Ionenkanal

Abstract

Abstract
Prostate cancer is the most commonly diagnosed malignancy in men in the
Western World. In 2003 malignancies of the prostate will be the second most
common fatal cancer in men after lung cancer as estimated by the American
Cancer Society. Despite the tremendous efforts made in the past to improve the
treatment of prostate cancer patients, there is still an urgent need for new markers
and therapeutic targets for medication.
The aim of this thesis was the identification of new genes relevant in prostate
cancer, which could be used in a small-molecule or antibody based therapy of
prostate cancers. Microdissected matched prostate cancer and normal tissues of
52 prostate cancer patients were hybridized to a proprietary high density Cancer-
Chip based on Affymetrix GeneChip technology. Using a bioinformatic analysis,
it was possible to identify TRPM8, which was highly overexpressed in 56% of
prostate cancer patients. Northern blot, dot blot and gene chip experiments
revealed that TRPM8 expression is extremely tissue specific. Of 400 patients and
23 tissues tested, TRPM8 expression could only be detected in the prostate and
neuroendocrine tumors.
Functionally, the protein belongs to the transient receptor potential channel
family of non-voltage gated proteins. It could be shown for the fist time that
TRPM8 subunits form homomers using FRET technology.
Molecular characterization of TRPM8 transcription revealed multiple splice
forms of TRPM8. Further, it was possible to identify a new mRNA present on
the opposite strand of TRPM8, which was 100% complementary to exon 11 of
TRPM8, thus it could possibly function as a regulatory RNA of TRP channel.
All of these isoforms were found to be even higher overexpressed in prostate
tumors than TRPM8 itself.
The promoter region of TRPM8 was identified using in silico methods and
confirmed in promoter reporter assays. Although a high androgen dependent
transcriptional activation of TRPM8 could be found by RT-PCR in LNCaP cells,
no androgen responsive elements was identifiable within the promoter region.
On the other hand three binding sites for the androgen dependent homeobox gene
NKX3.1 and several other homeobox genes were discovered.
The results of the thesis show that TRPM8 and its isoforms are, due to their
tissue specificity, ideal targets for the development of new therapeutic drugs for
the treatment of prostate cancer.
TRPM8
prostate
cancer
microarray
Ionchannel


Contents

1 INTRODUCTION...................................................................... 1
1.1 INCIDENCE OF PROSTATE CANCER........................................... 1
1.2 BIOLOGICAL FUNCTION OF THE PROSTATE.............................. 1
1.3 DEVELOPMENT OF PROSTATE CANCER ................................... 2
1.4 PATHOLOGICAL CLASSIFICATIONS OF PROSTATE CANCER....... 2
1.4.1 The TNM staging system for prostate cancer ................................3
1.4.2 The Gleason grading system ..........................................................4
1.5 TREATMENT OF PROSTATE CANCER ........................................ 5
1.5.1 Classical treatment.........................................................................5
1.5.2 New treatment forms......................................................................6
1.6 ANDROGENS IN PROSTATE CANCER ......................................... 6
1.7 DIAGNOSIS OF PROSTATE CANCER .......................................... 7
1.7.1 Prostate Specific Antigen...............................................................8
1.7.2 Regulation of PSA8
1.8 MICROARRAY ANALYSIS IN CANCER RESEARCH ..................... 8
1.9 TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL CHANNELS 10
1.9.1 The TRP superfamily ...................................................................10
1.9.2 TRPM 1 to 7.................................................................................12
1.9.3 TRPM8.........................................................................................13
1.10 CALCIUM SIGNALING......................................................... 13
1.11 GENETIC ALTERATIONS OF PROSTATE CANCER.................. 14
1.12 CONTROL OF GENE EXPRESSION ........................................ 14
1.13 AIM OF THE THESIS ........................................................... 17
2 RESULTS.................................................................................. 18
2.1 GENE CHIP EXPRESSION ANALYSIS OF PROSTATE CANCER
PATIENTS......................................................................................... 18
2.1.1 Expression of TRPM8 in prostate cancers...................................20
2.1.2 n human cell lines ..................................20
2.2 TRPM8 EXPRESSION IN HUMAN TISSUES ............................. 21
2.2.1 Electronic Northern of TRPM8....................................................21
2.2.2 Northern and Dot blot analysis of TRPM822
2.2.3 Real Time PCR of TRPM8 in matched prostate cancer patients.24
2.2.4 In situ hybridization of TRPM8 in prostate tumors and other
entities 25
2.3 FISH EXPERIMENTS OF TRPM8 ON 2.Q37.2 IN LNCAP CELLS
26
2.4 HOMOMULTIMERIZATION OF TRPM8 SUBUNTIS .................. 28
2.5 ACTIVATION OF TRPM8 BY THE COOLING AGENT ICILIN ...... 29
2.6 GENE CHIP ANALYSIS OF TRPM8 EXPRESSION IN 7 HUMAN
TISSUES ........................................................................................... 30
i Contents

2.7 TRPM8 EXPRESSION IN NEUROENDOCRINE TUMORS OF THE
LUNG 33
2.8 GENOMIC STRUCTURE OF TRPM8........................................ 33
2.9 IDENTIFICATION OF TRPM8 SPLICE VARIANTS..................... 34
2.9.1 Identification of the TRPM8-regulatory-RNA.............................36
2.9.2 Expression of TRPM8 splice variants in prostate tumors ...36
2.9.3 Characterization of TRPM8 Splice variant 16b...........................37
2.9.4 Generatio