Identifizierung und Charakterisierung von Muskeldystrophie Duchenne modifizierenden Genen und Stoffwechselwegen [Elektronische Ressource] = Identification and characterisation of muscular dystrophy Duchennne modifying genes and signal transduction pathways / von Stefanie Grunwald (geb. Lammel)

Stefanie Grunwald

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• Biologie

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• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 35
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

Identifizierung und Charakterisierung von
Muskeldystrophie Duchenne modifizierenden Genen
und Stoffwechselwegen
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von

Dipl. Ing. (FH) Stefanie Grunwald (geb. Lammel)
geb. am 25.08.1978 in Strausberg


Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön


Gutachter: 1. Prof. Dr. Hanspeter Herzel
2. Prof. Dr. Astrid Speer
3. Prof. Dr. Ina Koch
Datum der mündlichen Prüfung: 30. Juli 2009

Identification and characterisation of muscular
dystrophy Duchenne modifying genes and signal
transduction pathways
Dissertation
In fulfilment of the requirements for the academical degree of
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat)
in the subject biology
submitted to

faculty of Mathematics and Natural Sciences I
of the Humboldt-University Berlin
by

Dipl. Ing. (FH) Stefanie Grunwald (nee Lammel)
born on 25 August 1978 in Strausberg


President of the Humboldt University Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies

Decan of the Faculty of Mathematics and Natural Sciences I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schoen


Referee: 1. Prof. Dr. Hanspeter Herzel
2. Prof. Dr. Astrid Speer
3. Prof. Dr. Ina Koch
Date of viva voce: 30 July 2009
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For my family and
my unborn child

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Kurzfassung
Hintergrund und Zielsetzung: DMD ist die häufigste Form der Muskeldystrophie im
Kindesalter und bis heute unheilbar. Sie wird durch das Fehlen des Proteins Dystrophin
verursacht, welches verschiedene Signaltransduktionswege beeinflusst. Das Anliegen der
Arbeit ist die Untersuchung und Modulation von Signaltransduktionswegen, die als
alternative Therapiestrategie den Verlust von Dystrophin kompensieren könnten.
Experimentelle Strategie: Für die Charakterisierung von Dystrophin nachgeschalteten
Prozessen wurden mRNA-Expressionsanalysen in Muskelgeweben von DMD-Patienten und
einem DMD-Brüderpaar mit einem infrafamiliär unterschiedlichen Verlauf der DMD
durchgeführt. Aus diesen Expressionsdaten wurde erstmalig ein Petri-Netz entwickelt,
welches Dystrophin mit in diesem Zusammenhang bisher unbekannten
Signaltransduktionswegen verknüpft. Das Petri-Netz wurde auf Netzwerkintegrität und –
verhalten mittels Invarianten- (INA) und theoretischen Knockout- (Mauritius Maps) Analysen
untersucht. Durch beide Methoden läßt sich der maßgebliche Teilsignalweg bestimmen. In
diesem Signalweg wurden die Proteinaktivität und die Genexpression durch siRNA, Vektor-
DNA und chemische Substanzen in humanen SkMCs moduliert. Anschließend wurden die
Proliferation und die Vitalität der Zellen sowie auch die Expression auf mRNA- und Protein-
Niveau untersucht.
Ergebnisse: RAP2B und CSNK1A1 waren in dem DMD-Brüderpaar differentiell exprimiert
und konnten erstmalig in einem neuen, komplexen Signalweg in Zusammenhang mit
Dystrophin nachgeschalteten Prozessen dargestellt werden. Mittelpunkt dieses Signalweges
ist die De- und Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFATc. Seine Zielgene umfassen
neben anderen den negativen Proliferationsfaktor p21, das Dystrophin homologe UTRN und
den Differenzierungsfaktor MYF5. Folglich würde ein Anstieg von UTRN eine unerwünschte
Reduktion der Proliferationsrate von Myoblasten implizieren. Letzteres konnte bereits
nachgewiesen werden und stellte das Motiv für weitere Studien dar. Jedoch zeigten siRNA-
und Vektor-DNA-Experimente, daß NFATc nicht der ausschlaggebende Faktor für diese
Zielgene ist. Die Substanzen Deflazacort (DFZ) und Cyclosporin A (CsA) wurden dagegen
beschrieben, die Aktivierung von NFATc zu beeinflussen. Die Ergebnisse zeigten, daß beide
Substanzen die Proliferation von Myoblasten erhöhen können. Die gleichzeitige Applikation
von DFZ und CsA führte zu einem Anstieg der UTRN-Expression.
Schlußfolgerung: Die Modulation der Proliferation und UTRN-Expression ist unabhängig von
einander möglich. Entsprechend der Grundidee der Arbeit zeichnet sich eine neue
Therapiestrategie ab, welche Dystrophin nachgeschaltete Prozesse einbezieht.

Schlagwörter:
Muskeldystrophie Duchenne, DMD, Dystrophin, Utrophin, Signaltransduktionwege,
NFATc, CSNK1A1, RAP2B, Real-time PCR, Skelettmuskelzellen, Myoblasten, Petri
Netze, Systembiologie


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Abstract
Background and aim: DMD is the most common muscular dystrophy in childhood and
incurable to date. It is caused by the absence of dystrophin, what influences several signal
transduction pathways. The thesis is interested in the investigation and modulation of signal
transduction pathways that may compensate the lack of dystrophin as an alternative therapy
strategy.
Experimental strategy: To study Dystrophin downstream pathways the mRNA expression of
DMD patients and two DMD siblings with an intra-familially different course of DMD were
analysed in muscle tissue. On the basis of these expression data a Petri net was first developed
implicating signal transduction pathways and Dystrophin downstream cascades. Invariant
(INA) and theoretical knockout (Mauritius Maps) analyses were applied for studying network
integrity and behaviour. Both methods provide information about the most relevant part of the
network. In this part modulation of protein activity and of gene expression using siRNA,
vector-DNA, and chemical substances were performed on human SkMCs. Subsequently, the
cells were studied by proliferation and vitality tests as well as expression analyses at mRNA
and protein level.
Results: RAP2B and CSNK1A1 were differently expressed in two DMD siblings, and first are
part of a signal transduction pathway implicating Dystrophin downstream processes. The
central point of this pathway is the de- and activation of the transcription factor NFATc. Its
target genes are, among others, the negative proliferation factor p21, the Dystrophin
homologue UTRN, and the differentiation factor MYF5. Consequently, an increase in UTRN
implicates an undesirably reduced myoblast proliferation rate. Latter was found in DMD
patients and was target for further studies. But, siRNA and vector DNA experiments showed
that NFATc is not the decisive factor for the target genes. Deflazacort and cyclosporin A are
known to influence the activation of NFATc. The results first showed that both substances do
induce myoblast proliferation. The use of deflazacort in combination with cyclosporin A
resulted in an increase of UTRN expression.
Conclusion: The modulation of proliferation and UTRN-expression independently of each
other is possible. According to the basic idea of this study, a new therapeutic strategy
becomes apparent, which considers Dystrophin downstream processes.
Keywords:
Duchenne Muscular dystrophy, DMD, dystrophin, signal transduction pathways,
NFATc, CSNK1A1, RAP2B, Real-time PCR, skeletal muscle cells, myoblasts, Petri net,
systems biology

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Acknowledgement

This thesis was performed at the Humboldt-University and the University of Applied Sciences
in Berlin.

My utmost gratitude goes to Prof. Dr. Speer for the great counselling and support, for lending
me an ear at anytime, and for the confidence having placed in me to work on this fascinating
and multifarious project. Furthermore, I would like to express my sincere appreciation to
Prof. Dr. Koch for introducing in the world of Petri nets and mentoring of my thesis.

My thanks and appreciation goes to my advisor Prof. Dr. Herzel at the Humboldt-University
for his encouragement, and who assisted me with this dissertation through his thoughtful
advices.

For the great assistance and all excellent technical advises I want to thank the whole team of
the 5th floor of the study course biotechnology – especially Sabine Bucher, Franz Godt and
Kunigunde Stephani-Kosin.

I am indebted to thank the group of at Charité in Berlin for using their instrumental facilities –
without it wouldn't have been able performing this work.

Especially, I want to express my gratitude to Hans G. Hoffmann for the excellent
proofreading of my thesis and for his comprehensive advices on writing my dissertation in
English.

Above all, I thank my husband Steven for his benign encouragement and being my best
friend. Furthermore, my thanks go to my child Sebastian for giving me happiness and joy, and
having great patience for my work during leisure-time.

Moreover, and most importantly, I wish to thank my family for their unconditional support.

The work was supported by an operating grant from