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Impact virologique et pharmacologique de la complexation de la ribavirine aux cyclodextrines sur un modèle animal d'encéphalite rougeoleuse, Virologic and pharmacologic interest of ribavirin/cyclodextrin complexes : evaluation on experimental measles virus encephalitis in mice

De
193 pages
Sous la direction de Francine Kedzierewicz
Thèse soutenue le 17 décembre 2008: Nancy 1
La ribavirine est un agent antiviral à large spectre efficace in vitro contre de nombreux virus à ARN dont certains sont responsables d'encéphalites. In vivo la mauvaise diffusion de cet analogue nucléosidique au niveau de la barrière hémato-encéphalique, limite son efficacité dans le traitement des encéphalites virales. Des études antérieures ont montré la capacité des cyclodextrines natives à former des complexes d’inclusion avec la ribavirine et l’amélioration de l’activité antivirale de la ribavirine in vitro lorsque celle-ci est complexée à l’alpha- ou la bêta-cyclodextrine. Le bénéfice de cette complexation in vivo, a été évalué sur un modèle murin d'encéphalite utilisant une souche neuroadaptée du virus de la rougeole (CAM/RB) inoculée par voie intracrânienne chez la souris CBA/ca âgée de 3 à 4 semaines. Le développement de l’infection a été contrôlé par détermination de la charge virale dans le cerveau des souris, à l’aide d’une RT-PCR quantitative en méthode TaqMan amplifiant le gène N du virus de la rougeole et d’une gamme étalon externe. Lorsque les souris sont traitées par voie intrapéritonéale par 40 mg/kg de ribavirine complexée à l’alpha-cyclodextrine, la morbidité et la mortalité liées à l’encéphalite rougeoleuse sont diminuées par rapport à l’administration de ribavirine libre et la charge virale diminue de façon significative dans le cerveau au jour J6. La complexation à la bêta-cyclodextrine n’apporte pas de bénéfice comparé à la ribavirine libre. Ces données suggèrent que l’alpha-cyclodextrine améliore in vivo le passage de la ribavirine au travers de la barrière hémato-encéphalique. La cinétique de la ribavirine dans le cerveau des souris traitées par le complexe ribavirine/alpha-cyclodextrine a été étudiée de 30 minutes à 48 heures après l’administration de doses uniques ou répétées de ribavirine libre ou complexée à différents dosages. La ribavirine a été purifiée par une technique d’extraction en phase solide et quantifiée par chromatographie liquide haute performance après élaboration d'une gamme de calibration ex vivo. La quantité de ribavirine retrouvée dans le cerveau est plus élevée lorsque la molécule est injectée sous forme de complexe chez la souris saine ou infectée. Ces données illustrent l'amélioration de survie observée au préalable et ce modèle d'étude a permis de mettre en évidence l'impact virologique et pharmacologique de la complexation d'une molécule antivirale à l'alpha-cyclodextrine.
-Ribavirine Cyclodextrine Rougeole Encéphalite Activité antivirale Barrière hémato-encéphalique
The objective of this work was to study the antiviral activity of ribavirin on measles encephalitis infection when using cyclodextrins as carriers. Ribavirin is a water-soluble synthetic nucleoside with broad spectrum antiviral properties, but it is ineffective against major viral encephalitis because of a failure to cross the blood brain barrier. The use of cyclic oligosaccharides can promote the activity of many drugs and the benefit of the association of ribavirin with alpha- or beta-cyclodextrine has already been demonstrated in vitro. The antiviral activity of the ribavirin/cyclodextrin complexes has been evaluated in vivo using an experimental model based on intracranial injection of the rodent adapted CAM/RB strain of measles virus in CBA/ca mice. Measles encephalitis development was monitored daily by viral load determination in mice brain. Intraperitoneal administration of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin (40 mg/kg of ribavirin) decreased the morbidity and the mortality of measles virus infected mice compared to free ribavirin treatment and the viral load in the brain is reduced at day 6 post-inoculation. At the opposite beta-cyclodextrin did not enhanced ribavirin in vivo antiviral activity. The role of alpha-cyclodextrin thus required to be defined and notably the hypothesis of ribavirin permeation enhancement through the blood brain barrier. Ribavirin specific extraction from brain tissue was developed, based on a solid phase extraction. It was quantified by high performance liquid chromatography at different time points after intraperitoneal injection of single or multiple doses of free ribavirin or of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin. Whatever the tested doses, quantity of ribavirin in the brain is significantly higher when the drug is injected as a complex with alpha-cyclodextrin, in healthy or measles virus-infected mice. So pharmacokinetic of ribavirin in brain tissue explains the advantage of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin over ribavirin in protecting mice from intracerebral infection with measles virus and confirms the interest of cyclodextrin complexes for human central nervous system diseases treatment.
Source: http://www.theses.fr/2008NAN10117/document
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http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm NANCYUNIVERSITE,UniversitéHenryPoincaré
ECOLEDOCTORALE"BIOLOGIE,SANTEETENVIRONNEMENT"
THESE
Pourobtenirlegradede
DOCTEURDEL'UNIVERSITEHENRIPOINCARE
Discipline:ARN:BiogenèseetStructure/ Fonction
Présentéeetsoutenuepubliquement
par
HélèneJEULIN
le17Décembre2008
Titre
IMPACTVIROLOGIQUEETPHARMACOLOGIQUEDELA
COMPLEXATIONDELARIBAVIRINEAUXCYCLODEXTRINES
SURUNMODELEANIMALD’ENCEPHALITEROUGEOLEUSE
DIRECTEURSDETHESE:
MadameleDocteurFrancineKEDZIEREWICZ
MadameleDocteurVéroniqueVENARD
MEMBRESDUJURY:
MonsieurleProfesseurHenriAGUT(rapporteur)
MadameleBarbaraGARTNER(rapporteur)
MadameleDocteurFrancineKEDZIEREWICZ
MonsieurleProfesseurBrunoLINA
MonsieurleProfesseurPierreMUTZENHARDT
MadameleDocteurVéroniqueVENARDAnFrauProfessorDoctorBarbaraGärtner,
Sie haben angenomen diese These zu urteilen. Finden hier den Ausdruck unserer
respektvollendankarbeit.
AMonsieurleProfesseurHenriAgut,
Vousavezacceptédejugercettethèse,nousvousprionsdetrouvericil'expressiondenotre
respectueusereconnaissance.
AMonsieurleProfesseurBrunoLina,
Pour l'honneur que vous nous faites de participer à ce jury, veuillez accepter nos
remerciementslesplussincères.
AMonsieurleProfesseurPierreMutzenhardt,
Nous sommes très honorés de votre présence dans ce jury et nous vous sommes très
reconnaissantsdenousdonnervotreavissurcetravail.AMadameleDocteurFrancineKedzierewicz,
Vousavezacceptédedirigercetravail,nousvousremercionspourl'accueilquevousnous
avezréservéainsiquepourlaconfiancequevousnousavezportéeentoutescirconstances.
Votrecompétence,vosconseilsetvotrebienveillanceànotreégardnousontétéd'unegrande
aide.Puissecettethèseêtrelamarquedenotrereconnaissance.
AMadameleDocteurVéroniqueVenard,
Vous nous avez encadré dès le DEA. Vos grandes qualités humaines, votre disponibilité,
votregoûtdelarigueuretdelaperfectionainsiquevotrepersévérancenousontpermisde
meneràbiencetravail.Nousvousremercionspourvotresoutienetvosconseilsaviséstout
au long de notre thèse. Veuillez considérercetravailcommeletémoignagedenotre
gratitude.AMonsieurleProfesseurAlainLeFaoupournousavoirrecrutésauseindevotre
équipederechercheetdevotreéquipehospitalière.
A Madame le Professeur Chantal Finance et Monsieur le Professeur Alain
Lozniewskipournousavoiraccueillisdansvoslaboratoiresrespectifs.
A la mémoire de Monsieur le Professeur Bernard Fortier, pour nous avoir fait
confiance et nous avoir permis de finir notre thèse en tant qu'Assistante Hospitalo -
Universitaire.
AMonsieurleProfesseurClaudeMuller,mercipournousavoirsuivistoutaulong
de ce travail et pour l'aide technique que nous avons pu trouver au sein du Laboratoire
NationaldeSantéduLuxembourg.
A toute l'équipe dirigeante de l'Unité Mixte de Recherche 7565 et plus
particulièrementduGrouped'EtudedesVecteursSupramoléculairesduMédicament.Unmercitoutparticulieràceuxquim'ontentouréeaucoursdecetravail,Hermine,
Rania, Saoussan et Emmanuel qui étaient présents à mes débuts, Eric et Catherine du
GEVSM, aux autres chercheurs : Florence (MCU), Raphaël (MCU), Catherine, Chloé,
Maxime,Hugues,etparticulièrementàNicolasGrancherdontj'aipoursuiviletravail.
AElianepoursaprécieuseaidetechniqueetpourlesbonsmoments.
AStéphane,poursonsoutienetsonaidetechnique.
A toutes les techniciennes, aux cadres de santé, aux secrétaires et à M. Mayer,
animalier,duLaboratoiredeVirologieduCHUdeNancyBrabois.Jedédiecetravailàmesparents,mercipourtoutcequevousm'apportez.
Amesgrandsparents,
ABenoit,AgnèsetGuillaume,
A Corentine et Marie, votre amitié au sein du laboratoire m'est extrêmement
précieuse,
Atousmesamis,
AToi.SOMMAIRESOMMAIRE
INTRODUCTION......................................................................................................9
SYNTHESEBIBLIOGRAPHIQUE.......................................................................... 11
I. Infectionsdusystemenerveuxcentral.....................................................................................................12
I.1 Généralités...............................................................................................................................................12
I.2 Epidémiologiedesinfectionsviralesdusystèmenerveuxcentral..............................................................13
I.3 Syndromesinfectieuxdusystèmenerveuxcentral.....................................................................................15
I.3.1 Lesméningitesvirales.....................................................................................................................15
I.3.2 Lesencéphalites..............................................................................................................................15
I.3.3 Lesautresatteintesneurologiquesvirales........................................................................................16
I.4 Principauxvirusetfamillesdevirusresponsablesd'encéphalites...............................................................17
I.5 Physiopathologie.......23
I.6 Modèlesanimaux......24
I.7 Diagnosticdesinfectionsviralesneuro-méningées...................................................................................26
I.7.1 Diagnosticdirect............................................................................................................................26
I.7.2 Diagnosticindirect.........................................................................................................................26
II. Levirusdelarougeole...............................................................................................................................28
II.1 Classification........28
II.2 Historique............28
II.3 Epidémiologieettransmission.............................................................................................................28
II.4 Structure..............30
II.5 Réplicationvirale..32
II.5.1 Absorptionetentréeduvirus.........................................................................................................33
II.5.2 Fusion.............34
II.5.3 Transcription...35
II.5.4 Réplication......36
II.5.5 Assemblageduvirionetrelargage...................................................................................................36
II.6 Physiopathologie..37
II.6.1 Réplicationinvivo............................................................................................................................37
II.6.2 RôledesprotéinesVetC...............................................................................................................38
II.6.3 Persistanceetneurovirulence..........................................................................................................38
II.7 Clinique...............................................................................................................................................40
II.7.1 Rougeolecommune........................................................................................................................40
II.7.2 Complicationsneurologiques41
II.7.3 Autrescomplications......................................................................................................................42
II.8 Traitements..........44
II.8.1 Curatif.............44
II.8.2 Préventif..........45
III. Ribavirine................46
III.1 Généralités...........46
III.2 Ciblesvirales........48
III.3 Mécanismed'action.............................................................................................................................51
III.3.1 Inhibitiondel’inosinemonophosphatedéhydrogénase..............................................................51
III.3.2 Immunomodulation...................................................................................................................52
III.3.3 Inhibitiondu"coiffage"desARN..............................................................................................53
III.3.4 Inhibitiondelapolymérase........................................................................................................54
III.3.5 InductiondemutationslétalesdanslegénomedesvirusàARN................................................54
1III.4 Pharmacologiedelaribavirine.............................................................................................................56
III.4.1 Métabolismeeteffetscellulairesdelaribavirine.........................................................................56
III.4.2 Administrationparvoieorale.....................................................................................................56
III.4.3 Administrationparvoieparentérale...........................................................................................57
III.5 Toxicité...............................................................................................................................................57
III.5.1 Anémiehémolytique..................................................................................................................57
III.5.2 Tératogénicité............................................................................................................................58
III.5.3 Autreseffetsindésirables...........................................................................................................58
III.6 Moléculesdérivéesdelaribavirine.......................................................................................................58
III.6.1 Laviramidine.............................................................................................................................58
III.6.2 Dérivésestérifiés........................................................................................................................59
III.6.3 Ciblagehépatique.......................................................................................................................59
III.6.4 Lalévovirine..............................................................................................................................60
III.7 Ribavirineetencéphalites....................................................................................................................60
IV. LesCyclodextrines................................................................................................................................62
IV.1 Historique............62
IV.2 Généralités...........62
IV.3 Productiondescyclodextrines.............................................................................................................63
IV.4 Propriétés.............63
IV.5 Pharmacocinétiquedescyclodextrines.................................................................................................65
IV.5.1 Administrationparentérale.........................................................................................................65
IV.5.2 Administrationorale..................................................................................................................66
IV.6 Toxicitédescyclodextrines67
IV.6.1 Toxicitécellulaire.......................................................................................................................67
IV.6.2 Formesorales............................................................................................................................67
IV.6.3 Formesparentérales...................................................................................................................68
IV.7 Applicationsindustriellesdescyclodextrines........................................................................................68
IV.8 Utilisationspharmaceutiquesdescyclodextrines..................................................................................69
IV.8.1 Applicationsparentérales...........................................................................................................69
IV.8.2 Applicationsentérales................................................................................................................71
IV.8.3 Applicationsophtalmiques.........................................................................................................71
IV.8.4 Applicationsintranasales............................................................................................................72
IV.8.5 Applicationsinhalées.................................................................................................................72
IV.8.6 Applicationsdermiques..............................................................................................................73
IV.8.7 Actionanti-infectieusepropre....................................................................................................74
IV.8.8 Formescommercialisées75
IV.9 Cyclodextrinesetribavirine78
V. LaBarrièrehémato-encéphalique.............................................................................................................80
V.1 Biologiedelabarrièrehémato-encéphalique........................................................................................80
V.1.1 Anatomie.......................................................................................................................................80
V.1.2 Vascularisationetcellulesendothéliales...........................................................................................80
V.1.3 Astrocytesetpéricytes....................................................................................................................81
V.2 Passagedelabarrièrehémato-encéphalique.........................................................................................82
V.2.1 Systèmesdetransport.....................................................................................................................82
V.2.2 Transportdemoléculesexogènes...................................................................................................84
V.2.3 Augmentationdeladélivrance........................................................................................................85
V.3 Explorationdelabarrièrehémato-encéphalique..................................................................................87
V.3.1 Limitesdesmodèlesinvitro87
V.3.2 Méthodesfondéessurlesanimaux..................................................................................................87
V.4 Pathologiesdelabarrièrehémato-encéphalique...................................................................................90
V.4.1 Modificationdesjonctionsserrées90
V.4.2 Altérationdessystèmesdetransport...............................................................................................91
V.4.3 Migrationdesleucocytes.................................................................................................................92
V.5 Barrièrehémato-encéphaliqueetribavirine..........................................................................................92
V.6 Bhémato-encéphaliqueetcyclodextrines92
2MATERIELETMETHODES.................................................................................. 94
VI. Matériel..................................................................................................................................................95
VI.1 Matérielutilisépourlesétudesd'activitéantiviraleinvivo......................................................................95
VI.1.1 Réactifsetconsommables..........................................................................................................95
VI.1.2 Souris.........96
VI.1.3 Souchesdevirus........................................................................................................................96
VI.1.4 Appareillagesdebiologiemoléculaire.........................................................................................97
VI.2 Matérielutilisépourlesétudespharmacocinétiques.............................................................................97
VI.2.1 Réactifsetconsommables97
VI.2.2 Appareillages.............................................................................................................................98
VII. Méthodes................99
VII.1 Etudeinvivodel'activitéantiviraledescomplexes................................................................................99
VII.1.1 Préparationdescomplexes.........................................................................................................99
VII.1.2 Entretiendesanimaux...............................................................................................................99
VII.1.3 Inoculation................................................................................................................................99
VII.1.4 Traitement100
VII.1.5 Déterminationdeladoselétale50delaribavirine,del’alpha-etlabêta-cyclodextrineetdes
complexesribavirine/alpha-cyclodextrineetribavirine/bêta-cyclodextrine..................................................100
VII.1.6ndelachargevirale.............................................................................................100
VII.1.7 Protocoled’évaluationdel’activitéantivirale............................................................................102
VII.2 Etudepharmacocinétiqueducomplexe103
VII.2.1 Préparationdel’échantillonpourl’extractionenphasesolide...................................................103
VII.2.2 Extractionenphasesolide.......................................................................................................103
VII.2.3 Chromatographieliquidehauteperformance105
VII.2.4 Réalisationd’unegammedequantificationexvivo.....................................................................106
VII.2.5 Déterminationdelapharmacocinétiquedelaribavirinedanslecerveau...................................106
RESULTATSETDISCUSSION.............................................................................. 108
VIII. Activitéantiviraleinvivo.....................................................................................................................109
VIII.1 Démarcheexpérimentale..............................................................................................................109
VIII.2 Problèmesrencontrés...................................................................................................................109
VIII.3 Résumédel'article........................................................................................................................110
VIII.3.1 Complexeribavirine/alpha-cyclodextrine.................................................................................110
VIII.3.2 Complexeribavirine/bêta-cyclodextrine...................................................................................118
IX. Etudepharmacocinétiqueducomplexeribavirine/alpha-cyclodextrine........................................124
IX.1 Démarcheexpérimentale124
IX.2 Résumédel'article.............................................................................................................................126
CONCLUSIONSETPERSPECTIVES................................................................... 150
REFERENCES....................................................................................................... 153
3