Improving methods for the study of membrane proteins by solid state NMR [Elektronische Ressource] / von Christoph Kaiser

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• Publié par: goethe_universitat_frankfurt_am_main
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 10
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 40 Mo

Extrait

Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
vorgelegt beim Fachbereich 14
der Johann Wolfgang Goethe -Universit at
in Frankfurt am Main
von
Christoph Kaiser
aus Hanau
Frankfurt 2009
Improving methods for the
study of membrane proteins
by
solid-state NMRvom Fachbereich 14 der Johann Wolfgang Goethe - Universit at als Dissertation
angenommen.
Dekan: Prof. Harald Schwalbe
Gutachter : Prof. Clemens Glaubitz
Datum der Disputation :Diese Doktorarbeit wurde von Prof. Dr. Clemens Glaubtiz betreut und in
der Abteilung Membranbiophysik und Festk orper NMR des Instituts fur bio-
physikalische Chemie der Johann Wolfgang Goethe Universit at Frankfurt am
Main durchgefuhrt.Be excellent to each other
Bill & TedContents
1 Introduction 19
2 General Solid State NMR Theory 27
2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.2 Angular Momentum Operators . . . . . . . . . . . . 28
2.3 Propagators . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.4 Euler Angles and Wigner Matrices . . . . . . . . . . 31
2.5 Tensors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.6 The Nuclear Spin Hamiltonian . . . . . . . . . . . . . 33
2.7 Reference Frames . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.8 Spin Interactions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.8.1 The Secular Approximation . . . . . . . . . . 35
2.8.2 Zeeman and Chemical Shift Interactions . . . 36
2.8.3 Dipolar Interaction . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.8.4 J-coupling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.9 Radio Frequency Pulses . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.10 Magic Angle Spinning . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.11 The Density Matrix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.11.1 Time Evolution and Propagators . . . . . . . 39
2.11.2 The NMR Signal . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.12 The Average Hamiltonian Theory . . . . . . . . . . . 40
2.12.1 The Interaction Frame . . . . . . . . . . . . . 41
2.13 Theory of symmetry based recoupling sequences . . . 41
3 Sensitivity Enhancement for ssNMR Spectra: RELOAD 45
3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.2 Selective Pulses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.3 Inversion Recovery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.4 RELOAD CP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.5 Application of RELOAD to homo-nuclear correlation
spectra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
5CONTENTS
3.6 Application of RELOAD to hetero-nuclear correla-
tion spectra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.6.1 Hetero-nuclear Correlation via Cross Polariza-
tion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.6.2 Hetero-nuclear via REDOR . . . . 78
3.6.3 Double CP RELOAD . . . . . . . . . . . . . . 79
3.6.4 Redor RELOAD . . . . . . . . . . . . . . . . 83
3.6.5 The multi-spin problem . . . . . . . . . . . . 88
3.7 Materials and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.7.1 Sample . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.7.2 NMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.7.3 Computation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.8 Conclusion and Outlook . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4 Symmetry Based Hetero-nuclear Polarization Trans-
fer: R70 91
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
4.2 Simulations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
4.2.1 Symmetry based heteronuclear transfer . . . . 93
4.3 Materials and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.3.1 Samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.3.2 Computation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.3.3 NMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.4 Experimental Veri cation and Results . . . . . . . . . 98
4.5 Conclusion and Outlook . . . . . . . . . . . . . . . . 100
4.5.1 Acknowledgments . . . . . . . . . . . . . . . . 100
5 Double quantum ltered homonuclear correlation spec-
tra 101
5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.2 Materials and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
5.2.1 NMR pulse sequences . . . . . . . . . . . . . . 102
5.2.2 Setup and parameter values . . . . . . . . . . 104
5.2.3 Phase cycling . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
5.2.4 Processing, Analysis and Plotting . . . . . . . 104
5.2.5 Sample Preparation . . . . . . . . . . . . . . . 105
5.3 Results and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
5.3.1 Intensities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
5.3.2 Buildup rates . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
5.3.3 DOAM: assignment walks . . . . . . . . . . . 110
5.4 Summary and Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . 110
6CONTENTS
6 Minimizing Relaxation Losses during Acquisition: HEAT115
6.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
6.2 Experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
7 Processing Multidimensional Spectra Twice: DTD 123
7.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
7.2 Theory . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
7.3 Materials and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
7.3.1 Samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
7.3.2 Computation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
7.3.3 NMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
7.4 Results and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
7.4.1 Denoising . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
7.4.2 Truncation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
7.4.3 Measuring buildup curves using DTD . . . . . 133
7.4.4 Application of DTD to DGK Spectra . . . . . 135
7.5 Conclusion and Outlook . . . . . . . . . . . . . . . . 136
8 Solid State NMR on the Integral Membrane Protein
DGK 137
8.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
8.2 Biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
8.2.1 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
8.2.2 Expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
8.2.3 Puri cation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
8.2.4 Reconstitution . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
8.2.5 Activity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
8.3 NMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
8.3.1 Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
8.3.2 Temperature Dependence of DGK Spectra . . 147
8.3.3 Selective Unlabeling . . . . . . . . . . . . . . 148
8.3.4 Through Bond Spectroscopy . . . . . . . . . . 151
8.3.5 The Heteronuclear Overhauser E ect . . . . . 154
8.3.6 INEPT and HETCOR Spectra of DGK . . . . 155
8.3.7 Application of R70 to DGK . . . . . . . . . . 155
8.3.8 The E ect of Lipid Composition . . . . . . . . 159
8.3.9 The E ect of Deuteration on DGK spectra . . 160
8.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
A Inversion Recoveries 167
7CONTENTS
B Pulse programs 171
B.1 1D CP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
B.2 2D PDSD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
B.3 2D DP-TOBSY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
B.4 2D DOAM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
B.5 2D DOPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
16;16
B.6 1DR70 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1766
B.7 CP with 180 selective pulse and mixing time . . . . 177
B.8 1D RELOAD CP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
B.9 2DAD PDSD . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
B.10 2D DoubleCP RELOAD . . . . . . . . . . . . . . . . 180
B.11 2D REDOR RELOAD . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
B.12 HEAT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
C Software and Scripts 185
C.1 Symmetry based heteronuclear polarization transfer . 185
C.1.1 SIMPSON . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
C.1.2 Evaluation scripts . . . . . . . . . . . . . . . . 187
C.1.3 Pulse program generation script . . . . . . . . 189
C.2 Dual Transformation Denoising . . . . . . . . . . . . 190
C.2.1 Generate synthetic data using python . . . . . 190
C.2.2 Convert to NMRPipe format using SIMPSON 193
C.2.3 Process data with NMRPipe . . . . . . . . . . 193
C.2.4 Convert resulting spectrum to GNUPlot using
Python . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
C.2.5 Automatic evaluation using Python . . . . . . 195
D Expression Media 199
D.1 Media . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
D.1.1 De ned Medium . . . . . . . . . . . . . . . . 199
D.1.2 M9 Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
D.2 Bu ers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
D.2.1 SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
D.2.2 Preparation Bu ers . . . . . . . . . . . . . . . 201
E Materials 203
E.1 Chemicals Used . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203
E.2 Instruments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
E.3 NMR Spectrometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
F Eidesstattliche Erklarung 207
G Acknowledgments 209
8Abbreviations
ADP Adenosine Diphosphate
AHT Average Hamiltonian Theory
ATP Adenosine Triphosphate
ATR-IR Attenuated Total Re ection Infrared
BR Bacteriorhodopsin
CDP Cytosine Diphosphate
CL Cardiolipine
CP Cross Polarization

CS Chemical Shift (alw