In vitro and in vivo analysis of human cell-based immunotherapies for acute myeloid leukemia [Elektronische Ressource] / Stefani Spranger. Betreuer: Elisabeth Weiß

Stefani Spranger

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 8
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 10 Mo

Extrait

In vitro and in vivo analysis of human
cell-based immunotherapies for
acute myeloid leukemia






Dissertation zur Erlangung
des Doktorgrades der Naturwissenschaften
an der Fakultät für Biologie
der Ludwig-Maximilians-Universität München


Stefani Spranger


In vitro and in vivo analysis of human
cell-based immunotherapies for
acute myeloid leukemia




Dissertation zur Erlangung
des Doktorgrades der Naturwissenschaften
an der Fakultät für Biologie
der Ludwig-Maximilians-Universität München


Angefertigt am
Helmholtz Zentrum München
Institut für Molekulare Immunologie
unter der Betreuung von Prof. D. J. Schendel




vorgelegt von
Stefani Spranger








































Erstgutachter: Frau Prof. Dr. Elisabeth Weiß
Zweitgutachter: Herr PD Dr. Josef Mautner


Dissertation eingereicht am: 25.5.2011
Tag der mündlichen Prüfung: 19.09.2011
 











































“The best way to have a good idea is to have a lot of ideas.”
Linus Pauling
Table of Contents
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Table of Contents

Zusammenfassung 5
Summary 8
1 Introduction 10
1.1 The human immune system 10
1.1.1 Haematopoiesis and function 10
1.1.2 Development of T lymphocytes 12
1.1.3 T lymphocytes-mediated immunity 14
1.2 Acute myeloid leukemia - tumorigenesis of the immune system 15
1.3 Cancer immunosurveillance and immunoediting 17
1.4 Immunotherapy 20
1.4.1 A general survey 20
1.4.2 Dendritic cell-based vaccination 21
1.4.3 Adoptive T cell transfer 23
2 Project aims 26
2.1 Optimization of ex vivo-generated DC and in vivo evaluation 26
2.2 De novo-induction of AML-specific T lymphocytes and functional
analysis using xenograft mouse models 27
3 Discussion 29
3.1 Dendritic cell-based vaccine 29
3.1.1 Improvement of ex vivo-generated dendritic cells 29
3.1.2 Vaccination of humanized mice using matured dendritic cells 32
3.2 Adoptive T cell transfer 34
3.2.1 In vitro generation of antigen-specific T lymphocytes 34
3.2.2 Characteristics of TCR-modified lymphocytes 37
3.2.3 Adoptive transfer of TCR-modified lymphocytes 40
3.3 Outlook 43
4 Literature 46
5 Original publications and manuscripts as part of the
cumulative thesis 70
Ehrenwörtliche Versicherung
Acknowledgments
Curriculum Vitae
Zusammenfassung
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Zusammenfassung

Konventionelle Therapien, wie die operative Entfernung von Tumoren oder
chemotherapeutische Ansätze, sind zwar bei der Beseitigung von soliden
Tumoren besonders effizient, scheitern jedoch häufig daran, streuende
Tumorzellen zu beseitigen ("Minimal Residual Disease"). Meist sind es aber
genau diese Zellen, die Metastasen oder auch Rezidive verursachen. Sowohl die
systemische Verteilung als auch die Langlebigkeit dieser Zellen in den für das
Immunsystem schwer zugänglichen Nischen stellen die Krebstherapie vor eine
besondere Herausforderung. Aus diesem Grunde ist die Kombination aus
konventioneller Therapie und einer zusätzlichen Aktivierung des Immunsystems
ein viel versprechender Ansatz in der Krebstherapie, um Tumorzellen mit
metastasierendem Potenzial zu eliminieren.
Vor allem bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) bedeuten
diese im Körper verbleibenden Tumorzellen eine lebensbedrohliche Gefahr, die
nicht selten (70 % der Patienten) mit Rezidiven einhergeht. Deshalb sind gerade
für die Bekämpfung von Leukämien weiterreichende Therapieformen von
besonderer Bedeutung. In meiner Arbeit habe ich mich vor allem auf zwei
Formen der Immmuntherapie konzentriert. Zum einem, auf die Verwendung von
Dendritischen Zellen (DC) als therapeutisches Vakzin, zum anderen auf den
adoptiven Transfer von T-Zell-Rezeptor (TCR)-transgenen Lymphozyten.
Eine Möglichkeit, das Immunsystem zu aktivieren, besteht in der Anwendung
von ex vivo generierten DC, welche ein ausgezeichnetes immunstimulatorisches
Potenzial besitzen. Für eine Anti-Tumor-Immunantwort sollten die DC sowohl
+IFN-γ-produzierende CD4 -T-Zellen (Th1) wie auch zytotoxische T-Zellen (CTL)
und natürliche Killer-Zellen (NK) induzieren können. Innerhalb dieser
Doktorarbeit war es möglich, über einen Zeitraum von drei Tagen (3d), DC mit
einem aktivierenden Phänotyp zu generieren. Hierfür wurden synthetische Toll-
like-Rezeptor-3-,-7/8-Agonisten verwendet, welche eine Virus-abhängige
Aktivierung nachahmen. Die auf diese Weise generierten DC waren in der Lage,
hohe Mengen an bioaktivem IL-12 freizusetzen, und in der Folge, wirkungsvoll
Effektorzellen zu aktivieren. Verglichen mit 7d-DC, die derzeit in klinischen
Studien verwendet werden, konnte für die hier generierten 3d-DC eine
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verbesserte Fähigkeit zur Aktivierung des angeborenen (NK Zellen) als auch des
adaptiven Immunsystems (T-Zellen) nachgewiesen werden. Darüber hinaus
wurde ein humanisiertes Mausmodell etabliert, welches die In-Vitro-Ergebnisse
nullauch in vivo bestätigte. Hierfür wurden NOD/scid/IL2Rg -Mäuse mit humanen
peripheren mononukleären Zellen rekonstituiert und mit reifen DC immunisiert.
Im Einklang mit den in-vitro-Ergebnissen ergaben auch die in-vivo-
Untersuchungen, dass die kürzer kultivierten, TLR-aktivierten DC in der Lage
waren, eine potente anti-Tumor-Immunantwort zu induzieren.
Der adoptive T-Zelltransfer mit Hilfe von TCR-modifizierten Lymphozyten,
stellt eine elegante und relativ leicht umzusetzende Möglichkeit für die
Übertragung einer anti-Tumorantwort auf den Patienten dar. Bei diesem Ansatz
werden zuvor isolierte TCR-Sequenzen, und somit auch deren Antigen-
Spezifität, auf Lymphozyten des Patienten übertragen. Ein entscheidender
Schritt hierbei ist die Isolierung von T-Zellen, die einen TCR mit hoher Affinität für
Tumor-assoziierte Selbst-Antigene besitzen. Vor allem nicht im Thymus negativ
selektionierte Lymphozyten besitzen TCR mit hoher Affinität für das jeweilige
Antigen. Aus diesem Grund wurde ein fremdes MHC Molekül in Kombination mit
Epitopen von Tumor-assoziierten Antigenen für die Induktion hochaffiner T-
Zellen verwendet. In dieser Arbeit konnten T-Zellen mit hochaffinen TCR für die
Tumor-Antigene Tyrosinase, Survivin und HMMR (hyaluronan-mediated motility
receptor) gewonnen werden. TCR, die spezifisch für die beiden AML-assoziierten
Antigene HMMR und Survivin sind, wurden isoliert und in Empfänger-
Lymphozyten transferiert. Bei der Verwendung von Survivin-spezifischen TCR
konnte ein "Brudermord" der eingesetzten Lymphozyten festgestellt werden. Eine
Beobachtung, welche die Anwendung von Survivin-spezifischen TCR für den
TCR-Gen-Transfer erheblich einschränkt. Weitere Analysen ergaben, dass diese
Erkennung auf eine erhöhte Survivin-Expression in aktivierten Lymphozyten
zurückzuführen war.
Im Gegensatz zu Survivin-spezifischen TCR zeigten Lymphozyten, welche mit
HMMR-spezifischen TCR transduziert wurden, eine spezifische In-Vitro-
Reaktiviät gegen AML-Zellen. Neben der Funktionalität in vitro ist das In-Vivo-
Verhalten der TCR-modifizierten Lymphozyten für das therapeutische Ergebnis
von entscheidender Bedeutung. Um dies zu analysieren, wurde ein Mausmodel
etabliert, in welchem sowohl solide als auch leukämische humane Tumorzellen in
6 Zusammenfassung
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nullNOD/scid/IL2Rg Mäusen verwendet wurden. Ein signifikanter Rückgang der
Tumorlast konnte nach einem Transfer von Lymphozyten, welche zuvor mit
einem HMMR-spezifischen TCR modifiziert worden waren, beobachtet werden.
Der Rückgang des Tumorwachstums konnte noch verstärkt werden, wenn die
Empfänger-Lymphozyten einen Zytokin-induzierten Gedächtnis-Phänotyp
aufwiesen. Im Einklang mit den In-Vitro-Analysen stellte sich heraus, dass ein Il-
15-induzierter (Effektor-Ged