Influence d'un phosphate de calcium substitué en strontium sur la physiologie de l'ostéoblaste humain en culture et évaluation de son potentiel de réparation osseusse chez la souris, Strontium substituted calcium phosphate influence on human osteoblasts physiology and evaluation of his potential bone healing capability on a mouse model.

Julien Braux

Description

Sous la direction de Dominique Laurent-Maquin, Patrice Laquerriere
Thèse soutenue le 02 février 2011: Reims
Les phosphates de calcium sont des biomatériaux couramment utilisés dans de nombreuses spécialités médicales. L'amélioration de ces biomatériaux vise à augmenter leur ostéointégration et leur bioactivité. Le strontium possédant d'intéressantes capacités de modification de la physiologie osseuse, l'incorporation de ce dernier au sein de phosphates de calcium par substitution ionique pourrait permettre un déplacement de la balance osseuse vers la formation osseuse.Notre travail a permis de démontrer la capacité des particules de phosphates de calcium substitués en strontium à augmenter la prolifération des ostéoblastes en culture et à modifier l'expression et la synthèse des principales protéines impliquées dans la physiologie osseuse (Collagène de type I, Serpine H1, métalloprotéinases matricielles 1 et 2, inhibiteurs tissulaires des MMPs). Par ailleurs, la poudre de phosphates de calcium ne contenant pas de strontium a entrainé une sécrétion accrue de chimiokines pro-inflammatoires (MCP-1 et GRO-?) qui n'a pas été observée pour la poudre substituée. Enfin, des études in-vivo réalisées dans un modèle de défaut osseux murin a permis de démontrer une plus grande résorbabilité de la poudre contenant du strontium et sa plus grande capacité à stimuler la réparation osseuse.
-Os et tissu osseux
-Metalloproteases
-Souris de lignée C57BL
-Collagène de type1
-Strontium
-Ostéoblastes
-Phosphate de sodium
-Matrix metalloproteinases
-Test ELISA
-Chimiokine CXCL1
Calcium phosphate are widely used in medicine. Their upgrade tend to enhance their biocompatibility and their bioactivity. Strontium has interesting capability to modify the bone physiologie. Its incorporation in calcium phosphates could lead to modify the bone balance toward osteogenesis.The present work reveal the capacities of such biomaterials to enhance the replication of osteoblasts ant to modify the expression and the synthesis of proteins implicated in the bone balance (type I collagen, serpinH1, Matrix metalloproteinases 1 and 2, tissular inhibitors of MMPs). Moreover, non substituted calcium phosphate powders enhance the expression and synthesis of inflammatory cytokines (MCP-1 and Gro-a). This fact was not observed with the non substituted powder. In-vivo studies on a mouse model permit us to demonstrate the higher resorbability and the higher bone healing capability of the substituted powder.
-Bone and bones
-Metalloproteases
-Mice inbred c57bl
-Collagen type I
-Strontium
-Osteoblasts
-Sodium phosphate
-Matrix metalloproteinases
-Enzyme-Linked immunosorbent assay
-Chemokine cxcl1
Source: http://www.theses.fr/2011REIM0201/document

Sujets

• Métalloprotéinase matricielle
• Phosphate de sodium
• Enzyme-linked immunosorbent assay

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 64
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 9 Mo

Extrait

UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE
U.F.R. D‟ODONTOLOGIE

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE REIMS
CHAMPAGNE ARDENNE


Discipline : Sciences Biologiques

Présenté par

Julien Braux

Influence d'un phosphate de calcium substitué en strontium sur la
physiologie de l'ostéoblaste humain en culture et évaluation de son
potentiel de réparation osseuse chez la souris


Soutenue publiquement le 2 février 2010



JURY

Président Pr. Pierre MARIE (Paris)
Rapporteurs Pr. Jean-Christophe FRICAIN (Bordeaux)
Pr. Henri TENENBAUM (Strasbourg)
Directeurs de thèse Pr. Patrice LAQUERRIERE (Strasbourg)
Pr Dominique LAURENT-MAQUIN (Reims)
1
REMERCIEMENTS


Je remercie Monsieur le Professeur Jean-Christophe FRICAIN, Professeur à l‟INSERM
U577 de Bordeaux, et Monsieur le Professeur Henri TENENBAUM, Professeur à l‟INSERM
U977 de Strasbourg, d‟avoir accepté d'être rapporteurs de ce travail de thèse.

Je remercie Monsieur le Professeur Pierre MARIE de l‟INSERM U606 de Paris d‟avoir
accepté de présider le jury de cette thèse et de juger ce travail.

Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Madame le Professeur Dominique
LAURENT-MAQUIN pour m'avoir permis de réaliser mes travaux de recherche au sein de
l‟UMR-S 926 Interfaces Biomatériaux/Tissus-Hôtes. Merci de m'avoir accordé votre
confiance et merci pour votre disponibilité. Merci enfin d‟avoir accepté de juger ce travail et
de m‟avoir initié à l‟enseignement et la recherche.

Un immense merci au Professeur Patrice LAQUERRIERE, mon directeur de thèse, pour
m'avoir proposé ce projet de recherche et m'avoir fait confiance afin de le mener à son terme.
Merci Patrice d‟être resté disponible malgré la distance.

Je remercie le docteur Olivier CHASSANDE pour son accueil, sa disponibilité et le temps
qu‟il m‟a consacré lors de mes passages à Bordeaux.

Merci également à l’ensemble de l’équipe de l‟unité INSERM U577 pour leur chaleureux
accueil.

Je tiens à remercier le Professeur Edouard JALLOT ainsi que le Docteur Jean-Marie
NEDELEC de Clermont-Ferrand d‟avoir fourni les poudres d‟hydroxyapatite sans lesquelles
ce travail n‟aurait pas été réalisable.

Merci au Docteur Jean-Marc SVOBODA pour son accueil au sein de la sous section de
Parodontologie ainsi qu‟à tous les membres de cette sous section pour leur soutien.

2 Je remercie également le Docteur Jacky JACQUOT et le Professeur Sandrine LORIMIER
pour leurs conseils et pour les discussions scientifiques enrichissantes que nous avons eues
ensemble.

Merci au Docteurs Marie-Paule GELEE et Jean-Christophe MAURIN pour leur sympathie
et leur bonne humeur. Jean-Christophe… ne lâche pas les macarons !!!

Merci à Sylvie BOUTHORS et Sylvie GUILLAUME pour leurs encouragements, leur aide et
leurs petits plats.
.
Merci à Christine GUILLAUME pour son aide à la réalisation de ce travail, pour sa
disponibilité et son soutien.

Merci au docteur Frédéric Velard pour tous les moments passés ensemble au laboratoire
comme à l‟extérieur, lors des congrès et des diverses formations. Merci pour sa collaboration
et son aide dans la rédaction des papiers.

Merci à tous mes amis pour tous ces moments passés ensemble qui font que l‟on se souvient
qu‟il y a une vie en dehors du labo et qu‟elle est géniale. Pour tout ça et le reste, merci à vous
tous.

Merci à l‟ensemble de ma famille pour son soutien. Merci particulièrement à mes grand-
parents sans qui mes études n‟auraient pas pu se dérouler dans ces conditions et également à
ma maman surtout d‟avoir toujours cru en moi et de m‟avoir soutenu.

Merci à Coralie, ma femme, de m‟avoir soutenu (et supporté…) toutes ces années et pour
celles à venir…
3 Sommaire

Sommaire 1
Liste des abréviations 5
Liste des illustrations 7
CONTEXT 13
INTRODUCTION 14
1. Le tissu osseux 15
1.1. Le squelette 15
1.2. Développement squelettique 15
1.3. Structure « multi-échelle » 16
1.4. Histologie du tissu osseux 18
1.4.1. La matrice organique 18
1.4.2. La phase minérale 32
1.4.3. L‟eau 33
1.4.4. Les cellules du tissu osseux 33
1.5. La physiologie osseuse : le remodelage osseux. 44
1.5.1. Le couplage 45
1.5.2. La séquence de remodelage 45
2. Les biomatériaux 50
2.1. Introduction 50
2.2. Classifications 50
2.3. Les biocéramiques phosphocalciques 51
2.3.1. Les modes d‟obtention 52
2.3.2. Paramètres physiques de développement des biomatériaux 54
2.4. Applications des phosphates de calcium 55
2.4.1. Les revêtements prothétiques 55
2.4.2. Le comblement osseux 57
2.4.3. Une nouvelle approche thérapeutique : l‟Individual Based Implant Therapy 59
2.5. Réactions biomatériaux-tissus hôtes 59
2.5.1. Réponse tissulaire 60
2.5.2. L‟Inflammation 62
2.5.3. Les cytokines. 66
3. Le strontium 68
3.1. Généralités 68
3.2. Sources naturelles du strontium 69
3.3. Utilisations 69
3.4. Propriétés pharmacologiques du ranélate de strontium 70
3.4.2. Propriétés pharmacodynamiques (AFSSAPS, 2010) 70
3.4.3. Proprharmacocinétiques 71
3.4.4. Déficience en strontium 72
3.4.5. Toxicité du strontium 73
3.4.6. Effets biologiques in vivo: 73
3.4.7. Effet biologique in-vitro 75
1 OBJECTIFS 79
MATERIELS ET METHODES 82
1. Matériels 83
1.1. Produits chimiques et réactifs 83
1.2. Kits. 84
1.3. Matériels. 84
1.4. Poudres d’HA et d’HA5%. 85
2. Méthodes 86
2.1. Evaluation de la concentration en strontium efficace 86
2.1.1. Cultures cellulaires 86
2.1.2. Cultures cellulaires - Prolifération induite et toxicité du chlorure de strontium : Détermination de
2+la concentration efficace en Sr 87
2+2.1.3. Cultures cellulaires : Validation de l‟effet des poudres et de la concentration efficace en Sr sur
les cellules primaires – Tests d‟exclusion au bleu trypan 88
2+2.1.4. Cultures cellulaires : Validation de l‟effet des poudres et de la concentration efficace en Sr sur
les cellules primaires – MTS 88
2.1.5. Cultures cellulaires : Réalisation des banques d‟ARNm 88
2.2. Tests d’exclusion au bleu trypan - Prolifération induite et Toxicité du chlorure de strontium :
2+Détermination de la concentration efficace en Sr 88
2.3. Spectrométrie d’émission atomique à source plasma (Inductively-Coupled-plasma/ Atomic-Emission –
Spectrometry - ICP-AES) : Validation de l’indice de substitution des poudres 89
2.4. Tests d’exclusion au bleu trypan et MTS : Validation de l’effet des poudres et de la concentration
2+efficace en Sr sur les cellules primaires 89
2.5. Microscopie électronique à balayage - Etude de la morphologie cellulaire 90
2.6. Etude de l’expression génique 90
2.6.1. Extraction, purification quantification et qualification des ARN totaux 90
2.6.2. Transcription inverse 91
2.6.3. Réalisation d‟un calibrateur 92
2.6.4. PCR Arrays 92
2.6.5. Design des primers et étude in silico 92
2.6.6. Mise au point des primers 95
2.6.7. Real Time PCR 95
2.7. Etude de la synthèse protéique 96
2.7.1. Dosage quantitatif de protéines par ELISA 96
2.7.2. Zymographie 96
2.7.3. Cytokines arrays 97
2.8. Etude in vivo 97
2.8.1. Implantation des souris 97
2.8.2. Microscanner 98
2.8.3. Histologie descriptive 101
2.9. Statistiques 101
RESULTATS 102
1. Prolifération induite et Toxicité du chlorure de strontium: Détermination de la concentration
2+efficace en Sr 103
1.1. Etude préliminaire sur la lignée MG-63 103
1.1.1. 7 jours. 103
1.1.2. 14 jours 104
1.1.3. 21 jours 104
1.1.4. Conclusion 105
1.2. Etude sur cellules primaires 105
2 1.2.1. Résultats à 7 jours 106
1.2.2. Résultats à 14 jours 106
1.2.3. Résultats à 21 jours. 107
1.2.4. Conclusions. 107
1.3. Spectrométrie d’émission atomique à source plasma (Inductively-Coupled-plasma/ Atomic-Emission
–Spectrometry - ICP-AES) : Validation de l’indice de substitution du substitut osseux 108
1.3.1. Etude du strontium 108
1.3.2. Etude du calcium 109
1.3.3. Conclusions 109
2. Prolifération induite par le strontium: Effets des poudres HA et HA sur la prolifération cellulaire. 5%
Comparaison avec la concentration d’effet maximal. 110
3. Microscopie électronique à balayage - Etude de la morphologie cellulaire et des rappor