Influence of angiotensin-converting enzyme inhibition on myocardial regeneration and cardiac remodeling mediated by bone marrow-derived cells in cardiac pressure overload [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Andrey Kazakov

Armin Schweitzer

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• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 20
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 16 Mo

Extrait

Aus der Klinik für Innere Medizin III
(Kardiologie, Angiologie und Internistische Intensivmedizin)
Direktor: Prof. Dr. M. Böhm
Fachbereich Klinische Medizin
Universität des Saarlandes, Homburg/Saar





Influence of angiotensin-converting enzyme inhibition
on myocardial regeneration and cardiac remodeling mediated by
bone marrow-derived cells in cardiac pressure overload



Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
der Medizinischen Fakultät
der UNIVERSITÄT DES SAARLANDES
2010








Vorgelegt von Andrey Kazakov,
geb. am 10.08.1976 in Gorkij (Russland)

Erklärung gemäß § 7 Abs. 1 Nr. 4

Ich erkläre hiermit an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter
und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen
Quellen direkt oder indirekt übernommen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quelle
gekennzeichnet.

Bei der Auswahl und Auswertung folgenden Materials haben mir die nachstehend aufgeführten
Personen in der jeweils beschriebenen Weise unentgeltlich geholfen:

S. Jäger und E. Becker bei der Durchführung der Operationen


Weitere Personen waren an der inhaltlich-materiellen Erstellung der vorliegenden Arbeit nicht
beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw.
Beratungsdiensten (Promotionsberaterinnen/Promotionsberater oder anderer Personen) in
Anspruch genommen. Außer den Angegebenen hat niemand von mir unmittelbar oder mittelbar
geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorgelegten Dissertation stehen.

Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder in ähnlicher Form in
einem anderen Verfahren zur Erlangung des Doktorgrades einer anderen Prüfungsbehörde
vorgelegt.

Ich versichere an Eides statt, dass ich nach bestem Wissen die Wahrheit gesagt und nichts
verschwiegen habe.

Vor Aufnahme der vorstehenden Versicherung an Eides statt wurde ich über die Bedeutung einer
eidesstattlichen Versicherung und die strafrechtlichen Folgen einer unrichtigen oder
unvollständigen eidesstattlichen Versicherung belehrt.

Homburg, den


Unterschrift des Promovierenden




Unterschrift der die Versicherung an Eides statt aufnehmenden Beamtin bzw. des aufnehmenden
Beamten.










2CONTENTS

6 1. Abbreviations……………………………………………………………………………..
2. Summary/Zusammenfassung…………………………………………………………… 8
3. Introduction……………………………………………………………………………… 13
3.1. Potential of heart regeneration………………………………………………….…... 13
3.2. Proliferation of distinct cells in the heart……………………………………….…... 15
3.3. Bone marrow stem cells for heart regeneration…………………………………….. 16
3.4. Stimulation of heart regeneration………………………………………………....... 17
3.5. Effects of the ACE inhibitor ramipril on cardiac remodeling……………………... 19
4. Aims of the study………………………………………………………………………… 20
5. Materials and methods…………………………………………………………………... 21
5.1. Materials……………………………………………………………………………. 21
5.1.1. Animals………………………………………………………………….... 21
5.1.2. Chemicals ………………………………………………………………… 21
5.1.3. Antibodies ………………………………………………………………... 22
5.1.4. Assays and kits……………………………………………………………. 24
5.1.5. Drugs……………………………………………………………………… 24
5.1.6. Solutions………………………………………………………………….. 24
5.1.7. Instruments………………………………………………………………... 26
5.1.8. Computer software ………………………………………………………. 28
5.2. Methods…………………………………………………………………………….. 28
5.2.1. Experimental groups……………………………………………………… 28
5.2.2. Transverse aortic constriction……………………………………………. 28
5.2.3. Bone marrow transplantation…………………………………………….. 29
5.2.4. Fluorescence-activated cell sorter analysis………………………………. 29
5.2.4.1. FACS-Immunostaining of peripheral blood cells……………… 29
5.2.4.2. FACS-Immf bone marrow cells………………… 30
5.2.5. Migration assay of spleen-derived EPC`s………………………………… 30
5.2.6. Disc angiogenesis model…………………………………………………. 31
5.2.7. Blood pressure measurement……………………………………………... 31
5.2.8. Histology………………………………………………………………….. 32
5.2.8.1. Preparation of paraffin sections and deparaffinization………… 32
5.2.8.2. Hematoxylin-eosin staining……………………………………. 32
5.2.8.3. Picrosirius red staining…………………………………………. 32
3 5.2.9. Immunostaining…………………………………………………………... 33
5.2.9.1. Basic principle…………………………………………………. 33 5.2.9.2. Antigen retrieval……………………………………………….. 33
5.2.9.3. Staining methods………………………………………………. 33
5.2.9.4. Two-step indirect method……………………………………… 33
5.2.9.5. Streptavidin-biotin method…………………………………….. 34
5.2.9.6. Tyramide-amplification method……………………………….. 34
5.2.9.7. Control of immunostaining…………………………………….. 34
5.2.10. Apoptosis detection……………………………………………………….. 35
5.2.11. Section examination and tissue morphometry……………………………. 35
5.2.12. Analysis of HIF-1 α-expression…………………………………………… 36
5.2.12.1. RNA isolation………………………………………………... 36 5.2.12.2. Reverse transcription………………………………………… 37
5.2.12.3. Quantitative RT-PCR………………………………………… 37
5.2.13. Analysis of HIF-1 α protein content by Western blotting………………… 38
5.2.13.1. Protein isolation and measurement of protein concentration… 38
5.2.13.2. Gel electrophoresis and electrophoretic transfer of proteins… 38
5.2.13.3. Immunovisualization…………………………………………. 39
5.2.13.4. Densitometry…………………………………………………. 39
5.2.14. Statistical analysis………………………………………………………… 39
6. Results……………………………………………………………………………………. 40
6.1. Hemodynamic data and myocardial hypertrophy ………………………………….. 40
6.2. Heart tissue remodeling…………………………………………………………….. 42
6.2.1. Cardiomyocyte hypertrophy……………………………………………… 42
6.2.2. Cardiac fibrosis…………………………………………………………… 44
6.2.3. Cell turnover in the left ventricular myocardium………………………… 46
6.2.3.1. Cycling cardiac cells…………………………………………. 46
6.2.3.2. Apoptosis…………………………………………………….. 49
6.3. Neoangiogenesis……………………………………………………………………. 53
6.3.1. Extracardiac neoangiogenesis ……………………………………………. 53
6.3.2. Endothelial progenitor cells ……………………………………………… 53
6.3.2.1. FACS-analysis data………………………………………….. 54
6.3.2.2. Migration assay data…………………………………………. 55
6.3.3. Capillarisation of the left ventricle …………………………………......... 56
6.3.4. Bone marrow-derived endothelial cells ………………………………….. 60
4 6.4. Bone marrow-derived myocyte progenitor cells…………………………………… 62
6.5. Hypoxia-inducible factor 1 alpha…………………………………………………... 63
7. Discussion………………………………………………………………………………… 65
7.1. Effects of ACE inhibition on cardiac remodeling in TAC…………………………. 65
7.1.1. Transverse aortic constriction leads to pressure overload………………... 65
7.1.2. Amelioration of left ventricular hypertrophy and cardiac fibrosis……….. 65
7.1.3. Cardiac cell turnover……………………………………………………… 68
7.2. Cardiac and extracardiac neoangiogenesis…………………………………………. 70
7.3. Effects of ACE inhibition on the bone marrow-cardiac axis of myocardial
regeneration………………………………………………………………………… 73
7.3.1. Endothelial progenitor cells………………………………………………. 73
7.3.2. Mechanisms of ramipril-induced EPC mobilization……………………… 75
7.3.3. Myocyte progenitor cells…………………………………………………. 77
7.4. Conclusions……………………………………………………………….. 79
8. References………………………………………………………………………………... 81
9. Acknowledgments………………………………………………………………………... 97
10. List of publications…………………………………………………………….……….... 98
11. Curriculum vitae………………………………………………………………………… 101

























51. Abbreviations

ACE Angiotensin converting enzyme
Ac-SDKP N-acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro
Ang-(1-7) Angiotensin (1-7)
BMSC Bone marrow-derived stem cells
BM-SHAM Bone marrow-transplanted sham-operated mice
BM-SHAM+RAM marrow-transplanted sham-operated mice treated with
ramipril
BM-TAC Bone marrow-transplanted mice after transaortic constriction
BM-TAC+RAM Bone marrow-transplanted mice after transaortic constriction
treated with ramipril
BMT Bone marrow transplantation
BSA Bovine serum-albumin
CSC Cardiac stem cells
EPC Endothelial progenitor cells
EPO Erythropoietin
ESC Embryonic stem cells
FACS Fluorescence-activated cell sorter
Fig.Figure
FITC Fluorescein isothiocyanate
G-CSF Granulocyte/macrophage colony stimulating factor
GFP Green fluorescent protein
H&E Hematoxylin-eosin staining
HIF-1 α Hypoxia-inducible factor 1 alpha
HRP Horse radish peroxidase
LV Left ventricle
LVEF Left ventricular ejection fraction
LVH Ler hypertrophy
MEF-2 Myocyte enhancer factor-2
MIMyocardial infarction
MSC Mesenchymal stem cells
PBS Phosphate buffered saline
PE Phycoerythrin
PECAM-1 Platelet endothelial cell