Influence of oxygenated perfluorocarbon (oxyPFC) on survival and free radical production of ischemic cardiomyocytes [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Jin Wang

Xia

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Aus der Medizinischen Universitätsklinikder Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.Abteilung Innere Medizin IIISchwerpunkt Kardiologie und AngiologieInfluence of Oxygenated Perfluorocarbon (oxyPFC) on Survival andFree Radical Production of Ischemic CardiomyocytesINAUGURAL-DISSERTATIONZur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultätder Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.vorgelegt 2004vonJinWanggeboren in Beijin, ChinaiDekan: Prof. Dr. med. J. Zentner1. Gutachter: Prof. Dr. med. C. Hehrlein2. Gutachter: PD Dr. med. J. MartinJahr der Promotion: 2004ii本论文献给一贯支持我事业的家人和朋友To my husband, Ming Du, my son, William Du，my sister, Jing Wang, and my parentsiiiContents1.Introduction……………….……………………………………………………..111.1 Reperfusion injury……………………………………………………………..1 1.1.1 Definition of reperfusion injury…………………………………………...3 1.1.2. The mediators of reperfusion injury……………………………………...51.2. Therapeutic strategies for reperfusion injury…………………………………5 1.2.1. Free radical scavengers and antioxidants6 1.2.2. Inhibitors of neutrophils………………………………………………….6 1.2.3. Calcium channel blockers………………………………………………... 1.2.4. Administrtion of endogenous cardioprotectants – adenosine and nitric 6 oxide (NO)………………………………………………………………..7 1.2.5. Anti-apoptotic agents……………………………………………………..81.3 Perfluorocarbons..……………………………………………………………..8 1.3.1 History perspective………………………………………………………..8 1.3.

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• Publié le: 01 janvier 2004
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Aus der Medizinischen Universitätsklinik der AlbertLudwigsUniversität Freiburg i.Br. Abteilung Innere Medizin III Schwerpunkt Kardiologie und Angiologie

Influence of Oxygenated Perfluorocarbon (oxyPFC) on Survival and

Free Radical Production of Ischemic Cardiomyocytes

INAUGURALDISSERTATION

Zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der AlbertLudwigsUniversität Freiburg i.Br.

vorgelegt 2004 von JinWang

geboren in Beijin, China

i

Dekan:Prof. Dr. med. J. Zentner

1. Gutachter:Prof. Dr. med. C. Hehrlein

2. Gutachter:PD Dr. med. J. Martin

Jahr der Promotion: 2004

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本论文献给一贯支持我事业的家人和朋友

To my husband, Ming Du, my son, William Du，

my sister, Jing Wang, and my parents

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2. 3.

Contents Introduction… … … … … … .… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 1 1.1 Reperfusion injury… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 1  1.1.1 Definition of reperfusion injury… … … … … … … … … … … … … … … … ... 1  1.1.2. The mediators of reperfusion injury… … … … … … … … … … … … … … ... 3 1.2. Therapeutic strategies for reperfusion injury… … … … … … … … … … … … … 5  1.2.1. Free radical scavengers and antioxidants… … … … … … … … … … … … …5 6  1.2.2. Inhibitors of neutrophils… … … … … … … … … … … … … … … … … … … .  1.2.3. Calcium channel blockers… … … … … … … … … … … … … … … … … … ... 6  1.2.4. Administrtion of endogenous cardioprotectants – adenosine and nitric  oxide (NO)… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 6  1.2.5. Antiapoptotic agents… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 7 1.3 Perfluorocarbons..… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..8  1.3.1 History perspective… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 8   … … … … … … ...1.3.2 Chemical and physical properties of perfluorocarbons… 8   … … … … … … … … … … … … … ..1.3.3 Perfluorocarbon in the medical field.… 9  1.3.4 Perfluorocarbon in myocardial reperfusion injury… … … … … … … … … ... 11 Study objective… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 14 Materials and Methods… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 15 3.1 Materials… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 15   … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …3.1.1 Cell culture media… 15   … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .3.1.2 Chemicals… 15  3.1.3 Antibodies… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 17   … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...3.1.4 Kits…17   … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .3.1.5 Devices… 17  3.1.6 Software… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ... 18 3.2 Methods… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 18  3.2.1 Cardiomyocyte culture… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 18   … … … … … … … … … … … … …3.2.1.1 Preparation cells and maintenance… 18   … … … … … … … .3.2.1.1.1 Primary adult human cardiomyocyte culture…18

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  … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...3.2.1.1.2 Maintenance…  3.2.1.2 Freezing and thawing… … … … … … … … … … … … … … … … … … …  3.2.1.2.1 Cell freezing......… … … … … … … … … … … … … … … … … … … .  3.2.1.2.2 Recovery of cryopreserved cells… … … … … … … … … … ...… …  oxyPFC treatment and cell seeding conditions.… … … ..3.2.1.3 Hypoxia and   … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..3.2.1.3.1 Hypoxia…   … … … … … … … … … … … … … … … … … ..3.2.1.3.2 OxyPFC treatment…   … … … … … … … … … … … … … … .3.2.1.3.3 Seeding conditions of cells…  3.2.1.4 NAcetylcystein (NAC) treatment… … … … … … … … … … … … … ....  3.2.2 Fluorescence staining… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...   ....… … … … … … … ...3.2.2.1 HOAOPI triple staining to detect apoptosis…   … … … … … … … … … … …3.2.2.1.1 Preparation of reagents and buffers…   … … … … … … … … … … .3.2.2.1.2 Hypoxia and treatment with oxyPFC…  3.2.2.1.3 HOAOPI staining… … … … … … … … … … … … … … … … … … .  3.2.2.2 Hydrogen peroxide detection… … … … … … … … … … … … … … … …  3.2.2.2.1 Reagent preparation and cells seeding… … … … … … … … … … ...   … … … … … … … … ...3.2.2.2.2 Hypoxia, oxyPFC treatment and staining…   … … … … … … … … … … … … … … … ..3.2.2.3 Troponin I immunostaining.…  3.2.2.3.1 Preparation of reagents and buffers… … … … … … … … … … … …  3.2.2.3.2 Staining… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...  3.2.2.4 Mitochondrial staining… … … … … … … … … … … … … … … … … … ..  3.2.2.4.1 Preparation of reagents and buffers… … … … … … … … … … … …  3.2.2.4.2 Hypoxia, oxyPFC treatment and staining… … … … … … … … … ..  3.2.2.5 CuZn SOD immunostaining.… … … … … … … … … … … … … … … ...  3.2.2.5.1 Preparation of reagents and buffers… … … … … … … … … … … ...  3.2.2.5.2 Hypoxia and oxyPFC treatment… … … … … … … … … … … … … .  3.2.2.5.3 Staining… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...   … .… … … …3.2.2.6 Analysis of fluorescence staining and quantification...…   … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .3.2.3 ATP assay…   … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..3.2.3.1 Protein extraction…   … … … … … … … … … … …3.2.3.1.1 Preparation of reagents and buffers…

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  … … … … … … … … … … … … .3.2.3.1.2 Hypoxia and oxyPFC treatment…  3.2.3.1.3 Cell extraction… … … … … … … … … … … … … … … … … … … …   … … … … … … … … … … … … … … . Luciferase chemiluminescence… 3.2.3.2   … … … … … … … … … … …3.2.3.2.1 Preparation of reagents and buffers…  3.2.3.2.2 Luciferase chemiluminescence… … … … … … … … … … … … … ...  3.2.4 Superoxide detection… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …   … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …3.2.4.1 SOD blocking…   … … … … … … … … … … …3.2.4.1.1 Preparation of reagents and buffers…   … … … … … … … … … … … … .3.2.4.1.2 Hypoxia and oxyPFC treatment…  3.2.4.1.3 SOD blocking… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .  3.2.4.2 Lucigenin chemiluminescence… … … … … … … … … … … … … … … .  3.2.4.2.1 Preparation of reagents and buffers… … … … … … … … … … … …   … … … … … … … … … .… … … ..3.2.4.2.2 Lucigenin chemiluminescence…   … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .3.2.4.3 NADPH treatment…  3.2.4.3.1 Preparation of reagents and buffers… … … … … … … … … … … …  3.2.4.3.2 NADPH treatment… … … … … … … … … … … … … … … … … … .. Results… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .… 4.1 Culturing of human cardiomyocytes… … … … … … … … … … … … … … … … .. 4.2 Cell viability under hypoxia… … … … … … … … … … … … … … … … … … … ... 4.3 Cell viability at different oxyPFC concentration… … .… … … … … … … … … .. 4.4 Cell viability under treatment with additional antioxidant NAcetylcysteine  (NAC) and hydrogen peroxide production after reoxygenation  with oxyPFC… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..… … ..... 4.5 Superoxide dismutase (SOD) activity after oxyPFC treatment… … … .… … .… 4.6 Superoxide production after oxyPFC treatment… … … … … … … … … ...… … .. 4.7 NADPHstimulation of superoxide level with or without reoxygenation with  oxyPFC… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .… … ...… … ... 4.8 Mitochondrial membrane potential after oxyPFC treatment… … … ...… … … ... 4.9 ATPlevel after oxyPFC treatment… … … ...… … … … … … … … … … … … … .. Discussion… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 5.1 Perfluorochemicals in myocardial reperfusion injury… … … … … … … … … …

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5.2 Effects of oxygen free radicals… … … … … … … .… … … … … .… … … … … … .

5.3 Mechanisms of action of perfluorocarbons… … … … … … … … … … … … … …

Summary… … … … … … … … … … … … … … .… … … … … … … … … .… … … … ...

Zusammenfassung… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..

References… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...… …

Abbreviations… … … … … … .… … … … … … … ...… … … … … … … … … … … … ..

Acknowledgements…

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1. Introduction

1.1 Reperfusion injury Reestablishment of coronary flow (reperfusion) is necessary to resuscitate the ischemic or hypoxic myocardium. Timely reperfusion facilitates cardiomyocyte salvage and decreases cardiac morbidity and mortality. Modalities for reperfusion include thrombolysis, percutaneous coronary intervention (PCI), and coronary artery bypass grafting (CABG). Reperfusion of an ischemic area may lead to additional tissue injury beyond that generated by ischemia alone, this phenomenon is termed ‘reperfusion injury’ (Vermaet al., 2002).

1.1.1 Definition of reperfusion injury Reperfusion injury results in cardiomyocyte damage via myocardial stunning, microvascular and endothelial injury, and leads to irreversible cell damage or necrosis termed lethal reperfusion injury (Yellon and Baxter, 2000; Ambrosio and Tritto, 1999) (see Fig. 1).

Myocardial stunning Myocardial stunning is the bestestablished manifestation of reperfusion injury (Kloneret al., 2001; Ambrosio and Tritto, 2001). It is defined as ‘prolonged postischemic dysfunction of viable tissue salvaged by reperfusion’ (Kloner and Jennings, 2001a; 2001b; Braunwald and Kloner, 1982). In this scenario, reperfusion of either a globally or regionally ischemic myocardial tissue results in a period of prolonged, yet reversible, contractile dysfunction. The myocardium is essentially ‘stunned’ and requires a prolonged period of time before complete functional recovery (Kloner and Jennings, 2001a; 2001b; Kloneret al., 2001).

Microvascular dysfunction Microvascular dysfunction is another manifestation of reperfusion injury (Granger, 1999; Park and Lucchesi, 1999; Agati, 1999). Reperfusion causes marked endothelial cell

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dysfunction, which results in vasoconstriction, platelet and leukocyte activation, increased oxidant production, and increased fluid and protein extravasation. Although rare, severe microvascular dysfunction may limit adequate perfusion after reperfusion, a phenomenon termed noreflow . ‘’

Lethal reperfusion injury Lethal reperfusion injury is that reperfusion of a severely ischemic myocardium results in myocyte death and necrosis. This form of reperfusion injury is the most severe and is clearly irreversible (Vermaet al., 2002).

Fig. 1 Mechanisms and mediators of reperfusion injury.Reperfusion includes routine treatment for acute myocardial infarction like thrombolysis and percutaneous coronary intervention, coronary artery bypass grafting, and cardiac transplantation. Reperfusion injury results from several complex and interdependent mechanisms that involve the generation of oxygen free radicals, endothelial dysfunction and microvascular injury, alteration in calcium handling, altered myocardial metabolism, and insufficiency of endogenous protective mechanisms. Reperfusion injury results in myocardial stunning, microvascular and endothelial injury, and irreversible cell damage or necrosis termed lethal reperfusion injury.

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1.1.2 The mediators of reperfusion injury Several mechanisms and mediators of reperfusion injury have been described. The most frequently cited include oxygen free radicals, endothelial and microvascular dysfunction, intracellular calcium overload, altered myocardial metabolism, and endogenous protective mechanisms (Granger, 1999; Park and Lucchesi, 1999; Agati, 1999; Carden and Granger, 2000).

Generation of oxygen free radicals The generation of oxygen free radicals is a key process in the development of reperfusion injury (Beard al., et 1994). Bolliet al. first showed that potent oxidant radicals are produced within the first few minutes of reflow and play a crucial role in the development of reperfusion injury (Bolliet al.,1989). Molecules involved in free radical reactions include superoxide anion, hydroxyl radical, hydrogen peroxide, peroxynitrite, and hypochlorous acid. Free radicals contain an unpaired electron and are accordingly highly reactive (Beard al., et Oxygen free radicals can be generated by 1994). mitochondria during oxidative phosphorylation and by activation of cellular enzymes including NAD(P)H oxidase, cyclooxygenase, nitric oxide synthase and xanthine oxidase (Mohazzabet al.,1994; Bolliet al.,1989; Xia and Zweier, 1997). Oxygenderived free radicals produce damage by reacting with polyunsaturated fatty acids, resulting in the formation of lipid peroxides and hydroperoxides that damage the sarcolemma and impair the function of membranebound enzyme systems. Free radicals stimulate the endothelial release of platelet activating factor, which attracts more neutrophils and amplifies the production of oxidant radicals and the degree of reperfusion injury. Hydrogen peroxide also quench nitric oxide, exaggerating endothelial injury and microvascular dysfunction. In addition to an increased production, there is also a relative deficiency in endogenous oxidant scavenging enzymes, which further exaggerates free radicalmediated cardiac dysfunction (Jordanet al., 1999).

Endothelial dysfunction and microvascular injury Reperfusion causes marked endothelial cell dysfunction. It impairs endothelium dependent vasodilatation, whereas the responses to endotheliumdependent

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vasoconstrictors are exaggerated. Increased production of potent vasoconstrictors, such as endothelin1 and oxygen free radicals, increases coronary vasoconstriction and reduces blood flow. Furthermore, endothelial dysfunction facilitates the expression of a prothrombotic phenotype characterized by platelet and neutrophil activation, important mediators of reperfusion injury (Granger, 1999; Jordanet al., 1999; Carden and Granger, 2000).

Alterations in calcium turnover Ischemia and reperfusion are associated with increased levels of intracellular calcium. Intracellular calcium overload alters myofilament sensitivity to calcium (Gaoet al., 1996; 1997). The rise in intracellular calcium also causes an increase in mitochondrial calcium. This leads to a decrease of mitochondrial ability to generate ATP limiting metabolic recovery of the myocyte (Silverman and Stern, 1994).

Altered myocardial metabolism Production of lactate contributes to a delayed functional recovery of the myocardium (Raoet al., 2001). The activity of mitochondrial pyruvate dehydrogenase is inhibited by 40% after ischemia and remains depressed for up to 30 minutes after reperfusion (Meranteet al., 1998; Raoet al., 1998).

Insufficiency of endogenous protective mechanisms The most important endogenous protective mechanisms are adenosine production, opening of mitochondrial ATPsensitive potassium (mitoK+ATP) channels, and release of nitric oxide (NO) (Przyklenk, 2001). Adenosine is an endogenous cardioprotective agent and is present in low concentrations in the normal myocardium. It increases during ischemia and reperfusion and is released during ischemia exerting its beneficial effects via opening of mitoK+ATP channels (VintenJohansenet al., 1999; Olafssonet al., 1987). Endotheliumderived NO produces a variety of biological actions that indicate a protective role during myocardial ischemia and reperfusion. NO is a powerful vasodilator and may improve blood flow during reperfusion. In addition, NO inhibits adherence of

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