Integration of human papillomavirus type 16 DNA in cervical carcinogenesis [Elektronische Ressource] : design of a novel strategy for HPV16 integration site determination in cervical scrapes and analysis of HPV16-induced c-myc insertional mutagenesis / presented by Bo Xu

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• Biologie

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• Publié par: ruprecht-karls-universitat_heidelberg
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 83
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 30 Mo

Extrait

Dissertation
submitted to the
Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
for the degree of
Doctor of Natural Sciences














presented by
Diplom-Biologe Bo Xu
born in: Penglai, Shandong Province, P. R. China
Oral-examination:










Integration of Human Papillomavirus Type 16 DNA
in Cervical Carcinogenesis:
Design of a novel strategy for HPV16 integration site
determination in cervical scrapes and analysis of
HPV16-induced c-myc insertional mutagenesis
















Referees: Prof. Dr. Elisabeth Schwarz
Prof. Dr. Gabriele Petersen

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Acknowledgements
My very special gratitude goes to my supervisor Prof. Dr. Elisabeth Schwarz for
giving me the opportunity to pursue my PhD thesis in her group at DKFZ (F030), for
her excellent guidance and constant support during the past four years, and for the
critical reading of my dissertation manuscript.
My sincere thanks also go to Prof. Dr. Gabriele Petersen (University of Heidelberg)
for kindly being my second supervisor and to PD. Dr. Stefan Wiemann (DKFZ) for
acting as a member of my thesis advisory committee. I feel very grateful to both of
them for participating actively in my progress reports.
Within the Cancéropôle du Grand Est-DKFZ cooperation project, I would particularly
like to thank Dr. Véronique Dalstein and Prof. Dr. Christine Clavel in Reims
(Université de Reims Champagne-Ardenne) as well as Dr. Maëlle Saunier and Dr.
Jean-Luc Prétet in Besançon (Université de Franche-Comté) for providing clinical
DNA samples and performing the E2-E6 quantitative PCR.
Essential for the development of ASP16 strategy, I would like to thank Sasithorn
Chotewutmontri in our laboratory for writing the bioinformatics programs and for her
large contributions in the pyrosequence data analysis. I would also like to thank
Ursula Klos in our laboratory for technical assistance, and Ilona Braspenning-Wesch
for introduction into the Western blot technique.
I would like to thank Andreas Hunziker for Sanger sequencing and Dr. Gerald
Nyakatura for performing GS-FLX pyrosequencing at the DKFZ Genomics and
Proteomics Core Facility.
I would sincerely like to thank Dr. Jérôme Couturier for performing FISH and
karyotyping assays, and Dr. Martine Peter for performing DIPS-PCR and c-myc
quantitative PCR at the Institut Curie, Paris.
Finally, I wish to thank Prof. Dr. Frank Rösl and all the members at the Division of
Viral Transformation Mechanisms (F030) for offering a very comfortable working
atmosphere and plentiful scientific events.
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Zusammenfassung
Persistierende Infektionen mit einem humanen Papillomvirus (HPV) der Hochrisiko-Gruppe, meistens mit
HPV16, bilden die notwendige Voraussetzung zur Entstehung von Gebärmutterhalskrebs (Zervixkarzinom). Bei
der Tumorprogression kommt es häufig zur Integration der HPV-DNA in das Genom der Wirtszellen an
unterschiedlichen Zielorten. Die Integration von HPV-DNA kann durch Insertionsmutagenese zur Veränderung
flankierender zellulärer Gene führen und auch auf diese Weise zum Mehrstufenprozess der Karzinogenese
beitragen. Das primäre Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer neuen effizienten Strategie, die es
ermöglicht, HPV16-DNA-Integrationsstellen in ausgewählten Proben von präkanzerösen und kanzerösen
Zervixabstrichen auf Sequenzebene zu bestimmen.
Bei Verwendung von Restriktionsstellen-PCR zur HPV16-DNA-Integrationsanalyse stellte sich die
Zervixkarzinom-Zelllinie MRI-H186 als ein sehr interessanter Fall für HPV16-induzierte Insertionsmutagenese
des c-myc Proto-Onkogens heraus. Deshalb wurden im Rahmen der Arbeit detaillierte Untersuchungen
durchgeführt. Assoziiert mit der HPV16-DNA-Integration im c-myc-Locus wurde eine Überexpression von c-myc
auf mRNA- und Proteinebene festgestellt. Verschiedene Varianten integrierter HPV16-DNA wurden auf
Sequenzebene charakterisiert. Eine dieser Varianten zeigte eine starke Expression als myc-HPV16
Hybridtranskript sowie als MycHPV16E2 Fusionsprotein. Beide myc-HPV16-Hybridmoleküle sind ein
besonderes Charakteristikum von MRI-H186. Im MycHPV16E2-Fusionsprotein ist der aminoterminale Teil der
MYC-Transaktivierungsdomäne mit der Linker- und DNA-Bindungsdomäne des HPV16 E2-Proteins fusioniert.
Die Ergebnisse für MRI-H186 verstärken die Vermutung, dass Insertionsmutagenese, in diesem Fall die
Aktivierung/Mutation von c-myc, bei der Zervixkarzinom-Entstehung eine Rolle spielen kann.
Für die HPV16-DNA-Integrationsanalyse in klinischen Proben, von denen genomische DNA nur in Nanogramm-
Mengen und häufig degradiert zur Verfügung steht, wurde eine neue Strategie entwickelt und ausgetestet, die
die gleichzeitige Sequenzierung vieler DNA-Proben ermöglicht. Die Strategie erhielt die Bezeichnung ASP16,
da sie Gesamtgenom-Amplifikation (A), HPV16-DNA-Selektion (S) und Hochdurchsatz-Pyrosequenzierung (P)
gefolgt von bioinformatischer Datenanalyse miteinander kombiniert. Zwei ASP16-Experimente wurden
durchgeführt, mit denen die Ausführbarkeit der neuen Strategie bewiesen werden konnte. Die bekannte 3’ viral-
zelluläre Verbindungsstelle der integrierten HPV16-DNA in MRI-H186 konnte in beiden Experimenten
nachgewiesen werden. HPV16-DNA-Integrationsstellen wurden in solchen klinischen Proben identifiziert, die
einen hohen Anteil an integrierter HPV16 DNA enthielten. Krebsbezogene zelluläre Gene an den
Integrationsstellen, besonders Gli1 und Grem2, sind interessante Kandidaten für eine HPV16-induzierte
Insertionsmutagenese. Zukünftige Optimierungen der ASP16-Methode sollten hauptsächlich eine Erhöhung der
durchschnittlichen Sequenzlängen zum Ziel haben, damit alle möglichen viralen DNA-Bruchpunkte in der
HPV16 E1/E2-Region vollständig erfasst werden können.
Die ASP16-Strategie bietet erstmalig die Möglichkeit, in klinischen Proben von Zervixabstrichen die HPV16-
DNA-Integrationsstellen in einem Multiplex-Ansatz systematisch zu bestimmen, unter besonderer
Berücksichtigung der geringen Menge und Qualität der Proben-DNA. Dieses besondere Merkmal der ASP16-
Strategie wird eine Eingliederung der HPV16-DNA-Integrationsanalyse in Zervix-Screeningprogramme
ermöglichen. Die Verwendung der ASP16-Methode wird dazu beitragen, progressive und hochgradig
veränderte Zervix-Läsionen eindeutig zu identifizieren sowie weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen
der Zervixkarzinom-Entstehung zu erhalten. !"#$%&'$(
Abstract
Persistent infection with high-risk human papillomavirus (HPV) types, most frequently HPV16,
is a necessary cause of cervical cancer. Correlated with tumor progression, the circular HPV
DNA usually becomes integrated into the host cell genome with diverse target sites. HPV
DNA integration may induce alterations of flanking cellular genes by insertional mutagenesis
that contribute to the multistep process of carcinogenesis. The primary goal of this study was
the design of a novel strategy to determine HPV16 DNA integration sites at the sequence
level in selected pre-cancerous and cancerous lesions obtained from cervical scrapes.
While testing restriction-site PCR for HPV16 DNA integration analysis, cell line MRI-H186
was identified as an interesting case of HPV16-induced insertional mutagenesis of the c-myc
proto-oncogene. Associated with HPV16 DNA integration into the c-myc locus, over-
expression of c-myc was found at both mRNA and protein levels. In addition, several HPV16
integration variants were characterized at the sequence level. One of these variants is
strongly expressed as myc-HPV16 hybrid transcript and MycHPV16E2 fusion protein both
unique for MRI-H186. In MycHPV16E2, the amino-terminal part of the c-MYC trans-activation
domain is fused to the linker and DNA-binding domain of HPV16 E2. These data strengthen
the assumption that insertional mutagenesis, in this case c-myc activation/mutation,
contributes to cervical carcinogenesis.
For HPV16 DNA integration analysis in clinical samples from which genomic DNA is available
only in nanogramme amounts and often degraded, a novel strategy enabling the
simultaneous sequencing of multiple DNA samples was developed and examined in the
present study. This strategy was named ASP16 because it combines whole genome
amplification (A), HPV16 DNA selection (S) and high-throughput pyrosequencing (P) followed
by bioinformatics data analysis. Two ASP16 experiments were performed, which have proven
the feasibility of the novel strategy. The known 3’ viral-cellular junction sequence of integrated
HPV16 DNA in MRI-H186 was identified in both experiments. HPV16 DNA integration sites
were determined in clinical samples harbouring high percentages of integrated HPV16 DNA.
Cancer-related cellular genes near