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L'ilot génomique pks chez Escherichia coli : structure-fonction de la protéine ClbP et études épidémiologiques

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Description

Sous la direction de Richard Bonnet
Thèse soutenue le 11 mars 2011: Clermont Ferrand 1
L’ilot génomique pks de Escherichia coli et d’autres Enterobacteriaceae code des synthases depolycétides et de peptides non ribosomaux qui permettent l’assemblage d’un composé hybride polycétidepeptidenon ribosomal putative. Ce composé nommé colibactine induit des cassures double-brin de l’ADN descellules eucaryotes.La machinerie enzymatique codée par l’ilot pks comporte une protéine essentielle ClbP, atypique dansce type d’ilot. Nous avons montré que ClbP possède une partie N-terminale catalytique et périplasmique, et unepartie C-terminale associée à la membrane cytoplasmique. La structure cristalline de ClbP et des expériences demutagenèse ont révélé un site actif à sérine et des caractéristiques structurales originales, qui sont compatiblesavec une activité peptidase, confirmée par des analyses biochimiques. Dix homologues de ClbP ont été identifiésin silico dans des ilots génomiques de synthases de peptides non ribosomaux d’espèces bactériennes proches etéloignées. Tous les homologues testés ont présenté une promiscuité fonctionnelle avec ClbP. ClbP est donc leprototype d’une nouvelle sous-famille de peptidases, qui sont probablement impliquées dans la maturation decomposés peptidiques non ribosomaux.Par ailleurs, nous avons réalisé deux études épidémiologiques sur la prévalence de l’ilot pks dansl’espèce E. coli dans deux contextes physiopathologiques, l’urosepsis et les cancers coliques et rectaux. L’ilotpks était significativement associé aux souches issues d’urosepsis comparé à des souches commensales, et auxsouches issues de biopsies de tumeurs coliques comparé à des souches commensales ou issues de biopsies detumeurs rectales, de diverticuloses et de lésions iléales de maladie de Crohn.
-Colibactine
-Peptidase
-Peptides non ribosomaux
-Urosepsis
-Cancer colorectal
The pks genomic island of Escherichia coli and other Enterobacteriaceae encodes polyketide andnonribosomal peptide synthases that build a putative hybrid PK-NRP compound. This compound designatedColibactin induces DNA double-strand breaks in eukaryotic cells.The pks-encoded enzymatic machinery comprises an essential protein ClbP, atypical for this type ofgenomic islands. We report that ClbP harbors a catalytic and periplasmic N-terminal part, and a C-terminal partassociated to the cytoplasmic membrane. ClbP crystal structure and mutagenesis experiments revealed a serineactivesite and original structural features, which are compatible with peptidase activity confirmed bybiochemical assays. Ten ClbP homologs were identified in silico in NRPS-encoding genomic islands of closeand distant-related bacterial species. All tested ClbP homologs showed functional promiscuity with ClbP. ClbPis therefore a prototype of a new subfamily of peptidases, which are probably involved for the maturation ofNRP compounds.Furthermore, we undertook two epidemiological studies on the prevalence of pks island in E. coli in twopathophysiology contexts; urosepsis and colorectal cancers. The pks island was significantly associated withurosepsis strains compared to commensal strains, and strains isolated from biopsies of colon tumors comparedwith commensal strains or strains isolated from biopsies of rectal tumors, diverticulosis and ileal lesions ofCrohn disease.
-Colibactin
-Peptidase
-Nonribosomal peptides
-Urosepsis
-Colorectal cancer
Source: http://www.theses.fr/2011CLF1MM04/document

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Informations

Publié par
Nombre de lectures 57
Langue Français
Poids de l'ouvrage 9 Mo

Exrait

UNIVERSITE BLAISE PASCAL UNIVERSITE D’AUVERGNE
Année 2011 N° d’ordre
ECOLE DOCTORALE
DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
THESE
Présentée à l’Université d’Auvergne
Pour l’obtention du grade de Docteur d’Université
Spécialité : Microbiologie
par
DUBOIS Damien
L’ilot génomique pks chez Escherichia coli :
structure-fonction de la protéine ClbP et études épidémiologiques
Soutenue le 11 mars 2011
Président
F. DELBAC, Professeur, Université Blaise Pascal (Clermont-Ferrand)
Rapporteurs
C. GUILHOT, Directeur de recherche au CNRS, IPBS, Toulouse
W. SOUGAKOFF, Maître de Conférences, Université Pierre et Marie Curie (Paris VI)
Membres
E. OSWALD, Professeur, Université Paul Sabatier (Toulouse III)
R. BONNET, Professeur, Université d’Auvergne – Directeur de thèse
JE2526, usc-INRA 2018
Evolution des bactéries pathogènes et susceptibilité génétique de l’hôte
Clermont Université
28 place H. Dunant – 63001 Clermont-Ferrand Cedex
tel-00612631, version 1 - 29 Jul 20112
tel-00612631, version 1 - 29 Jul 2011DUBOIS Damien
L’ilot génomique pks chez Escherichia coli : structure-fonction de la protéine ClbP et études épidémiologiques
Résumé
L’ilot génomique pks de Escherichia coli et d’autres Enterobacteriaceae code des synthases de
polycétides et de peptides non ribosomaux qui permettent l’assemblage d’un composé hybride polycétide-
peptide non ribosomal putative. Ce composé nommé colibactine induit des cassures double-brin de l’ADN des
cellules eucaryotes.
La machinerie enzymatique codée par l’ilot pks comporte une protéine essentielle ClbP, atypique dans
ce type d’ilot. Nous avons montré que ClbP possède une partie N-terminale catalytique et périplasmique, et une
partie C-terminale associée à la membrane cytoplasmique. La structure cristalline de ClbP et des expériences de
mutagenèse ont révélé un site actif à sérine et des caractéristiques structurales originales, qui sont compatibles
avec une activité peptidase, confirmée par des analyses biochimiques. Dix homologues de ClbP ont été identifiés
in silico dans des ilots génomiques de synthases de peptides non ribosomaux d’espèces bactériennes proches et
éloignées. Tous les homologues testés ont présenté une promiscuité fonctionnelle avec ClbP. ClbP est donc le
prototype d’une nouvelle sous-famille de peptidases, qui sont probablement impliquées dans la maturation de
composés peptidiques non ribosomaux.
Par ailleurs, nous avons réalisé deux études épidémiologiques sur la prévalence de l’ilot pks dans
l’espèce E. coli dans deux contextes physiopathologiques, l’urosepsis et les cancers coliques et rectaux. L’ilot
pks était significativement associé aux souches issues d’urosepsis comparé à des souches commensales, et aux
souches issues de biopsies de tumeurs coliques comparé à des souches commensales ou issues de biopsies de
tumeurs rectales, de diverticuloses et de lésions iléales de maladie de Crohn.
Mots-clés : colibactine, peptidase, peptides non ribosomaux, urosepsis, cancer colorectal
Summary
The pks genomic island of Escherichia coli and other Enterobacteriaceae encodes polyketide and
nonribosomal peptide synthases that build a putative hybrid PK-NRP compound. This compound designated
Colibactin induces DNA double-strand breaks in eukaryotic cells.
The pks-encoded enzymatic machinery comprises an essential protein ClbP, atypical for this type of
genomic islands. We report that ClbP harbors a catalytic and periplasmic N-terminal part, and a C-terminal part
associated to the cytoplasmic membrane. ClbP crystal structure and mutagenesis experiments revealed a serine-
active site and original structural features, which are compatible with peptidase activity confirmed by
biochemical assays. Ten ClbP homologs were identified in silico in NRPS-encoding genomic islands of close
and distant-related bacterial species. All tested ClbP homologs showed functional promiscuity with ClbP. ClbP
is therefore a prototype of a new subfamily of peptidases, which are probably involved for the maturation of
NRP compounds.
Furthermore, we undertook two epidemiological studies on the prevalence of pks island in E. coli in two
pathophysiology contexts; urosepsis and colorectal cancers. The pks island was significantly associated with
urosepsis strains compared to commensal strains, and strains isolated from biopsies of colon tumors compared
with commensal strains or strains isolated from biopsies of rectal tumors, diverticulosis and ileal lesions of
Crohn disease.
Key-words : colibactin, peptidase, nonribosomal peptides, urosepsis, colorectal cancer
Jury : Président : Mr DELBAC Frédéric
Rapporteurs : Mr GUILHOT Christophe
Mr SOUGAKOFF Wladimir
Membres : Mr OSWALD Eric
Mr BONNET Richard – Directeur de thèse

Date de soutenance : 11 mars 2011
Adresse de l’auteur : 4 allée de Layrac – 31700 Blagnac
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tel-00612631, version 1 - 29 Jul 20114
tel-00612631, version 1 - 29 Jul 2011A Frédérique,
A Anaé, puis-je te transmettre le sens de la curiosité
A Olivier, pour notre collaboration qui s’est arrêtée trop tôt
A tous ceux qui me sont chers
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tel-00612631, version 1 - 29 Jul 20116
tel-00612631, version 1 - 29 Jul 2011Remerciements
Je remercie sincèrement,
Messieurs les Docteurs Guilhot et Sougakoff, d’avoir aimablement accepté d’être les
rapporteurs de cette thèse. Je suis fier de vous compter parmi mes juges et vous assure ma
reconnaissance et mon respect.
Monsieur le Professeur Delbac, d’avoir aimablement accepté de juger ce travail et de
présider notre jury.
Monsieur le Professeur Oswald, pour votre collaboration, d’avoir aimablement accepté de
juger cette thèse et de me permettre de poursuivre dans votre équipe.
Monsieur le Professeur Bonnet pour m’avoir accueilli comme Assistant et Doctorant dans son
laboratoire, pour sa disponibilité, son écoute, sa confiance, sa patience, son soutien et ses conseils
amicaux. Cela a été un plaisir de travailler dans ton équipe et sous ta direction. Trouve ici toute ma
gratitude et mon respect sincère.
Je tiens à remercier ceux sans qui ce travail n’aurait pas été possible,
Rolande, pour son dynamisme, son optimisme et son aide,
Marlène, pour sa gentillesse, ses conseils et son aide,
cela a été un plaisir de travailler avec vous, au-delà de mes espérances en arrivant au fond du
couloir,
Julien, pour les diverses collaborations et les nombreux échanges qui n’ont peut-être pas
révolutionné la bactériologie mais qui ont fait avancer mes projets et mes idées, et « Viva San
Diego !»,
Nathalie, pour sa rigueur scientifique, son dynamisme et son franc-parler,
Olivier, qui nous a quitté prématurément, pour notre collaboration amicale,
Bernadette, pour sa collaboration et son enthousiasme pour la problématique,
Pierre pour sa disponibilité, sa bonne humeur et nos échanges dans notre galère
« colorectale »,
Marie-Agnès pour ses conseils et son aide,
Antony, pour nos échanges et sa bonne humeur constante ; je te souhaite de réussir avec ClbP
et ses semblables.
Marie-Hélène et Claudine pour leur gentillesse et leur disponibilité.
Je remercie également,
Emilie et Caroline, mes successives charmantes collègues de bureau,
Tous ceux de l’équipe « Evolution des bactéries pathogènes et susceptibilité de l’hôte », en
particulier Madame le Professeur Arlette Darfeuille-Michaud pour m’avoir accueilli dans son unité,
Alexandra, pour son implication, et Sabah, pour son enthousiasme,
Jean-Philippe pour ses conseils,
Tous ceux du laboratoire de bactériologie du CHU de Clermont-Ferrand pour leur accueil et
leur bonne humeur,
Frédérique, mon épouse, pour sa compréhension et son soutien ces dernières années, pour
avoir accepté les nombreuses absences,
Reçois ma profonde gratitude,
Anaé, ma fille, pour ton sourire constant, avec toi, c’est facile d’être un papa qui « cherche ».
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tel-00612631, version 1 - 29 Jul 20118
tel-00612631, version 1 - 29 Jul 2011SOMMAIRE
LISTE DES FIGURES........................................................................................................... 12
LISTE DES TABLEAUX ...................................................................................................... 14
LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................. 15
INTRODUCTION.................................................................................................................. 17
CHAPITRE I – Revue bibliographique
I. LE CYCLE CELLULAIRE EUCARYOTE.............................................................. 23
A. STRATEGIE GENERALE DU CYCLE CELLULAIRE............................................................ 23
B. LES PRINCIPAUX ACTEURS DE LA REGULATION DU CYCLE CELLULAIRE ..................... 24
1. LES PROTEINES KINASES DEPENDANTES DES CYCLINES (CDK) ...................................... 24
2. LES CYCLINES ................................................................................................................. 24
3. LA PHOSPHORYLATION DES CDK .................................................................................... 25
4. LES INHIBITEURS DE CDK ............................................................................................... 26
5. LA REGULATION DE LA LOCALISATION INTRACELLULAIRE DES CDK .............................. 26
C. LES PRINCIPAUX EVENEMENTS DE REGULATION DU CYCLE ......................................... 27
D. LES POINTS DE CONTROLE DE LA QUALITE DU CYCLE CELLULAIRE ............................ 28
1. LA SIGNALISATION DES ALTERATIONS DE L’ADN............................................................ 28
2. LES POINTS DE CONTROLE G1/S ET G2/M ....................................................................... 30
3. LES POINTS DE CONTROLE EN PHASE S............................................................................. 32
4. LE POINT DE CONTROLE DU FUSEAU MITOTIQUE .............................................................. 32
II. LES CYCLOMODULINES DE ESCHERICHIA COLI ........................................... 33
A. LE FACTEUR CYTOTOXIQUE NECROSANT CNF............................................................. 34
1. LES CNF VARIANTS......................................................................................................... 34
2. STRUCTURE...................................................................................................................... 34
3. SUPPORT GENETIQUE ....................................................................................................... 34
4. MODE D’ACTION .............................................................................................................. 35
a) Sécrétion ................................................................................................................. 35
b) Translocation dans les cellules eucaryotes.......................................................... 36
c) Modification de la cible moléculaire .................................................................... 36
5. EXPRESSION PHENOTYPIQUE............................................................................................ 38
6. DISTRIBUTION.................................................................................................................. 39
7. ROLE DANS LE PROCESSUS INFECTIEUX............................................................................ 39
8. DES AGENTS CARCINOGENES POTENTIELS........................................................................ 40
B. LA TOXINE DE DISTENSION CYTOLETHALE CDT .......................................................... 43
1. LES VARIANTS CDT ET LEUR SUPPORT GENETIQUE ......................................................... 43
2. STRUCTURE DES CDT...................................................................................................... 43
3. MODE D’ACTION .............................................................................................................. 44
a) Sécrétion ................................................................................................................. 44
9
tel-00612631, version 1 - 29 Jul 2011b) Translocation dans les cellules eucaryotes.......................................................... 44
c) Altération de l’ADN et expression phénotypique ............................................... 46
4. DISTRIBUTION ET ROLE DANS LE PROCESSUS INFECTIEUX................................................ 46
5. DES AGENTS CARCINOGENES POTENTIELS........................................................................ 47
C. LE FACTEUR D'INHIBITION DU CYCLE CIF..................................................................... 48
1. DISTRIBUTION ET SUPPORT GENETIQUE............................................................................ 48
2. STRUCTURE...................................................................................................................... 48
3. MODE D’ACTION ET EXPRESSION PHENOTYPIQUE ............................................................ 49
4. UN AGENT CARCINOGENE POTENTIEL .............................................................................. 49
D. LA COLIBACTINE ............................................................................................................ 51
1. SUPPORT GENETIQUE ....................................................................................................... 51
2. TRANSCRIPTION DE L’ILOT PKS ........................................................................................ 51
3. DISTRIBUTION DE L’ILOT PKS AU SEIN DES ENTEROBACTERIES........................................ 53
4. ENVIRONNEMENT GENETIQUE DE L’ILOT PKS ................................................................... 53
5. EXPRESSION PHENOTYPIQUE ET MODE D’ACTION............................................................. 54
6. UN AGENT CARCINOGENE POTENTIEL .............................................................................. 56
III. LES POLYCETIDES ET LES PEPTIDES NON RIBOSOMAUX......................... 58
A. GENERALITES................................................................................................................. 58
1. LES METABOLITES SECONDAIRES..................................................................................... 58
2. INTERET DE L’ETUDE DES COMPOSES D’ORIGINE NATURELLE .......................................... 59
B. LA SYNTHESE DES COMPOSES PK ET NRP.................................................................... 61
1. LA LOGIQUE CHIMIQUE .................................................................................................... 62
a) L’activation des monomères................................................................................. 62
b) L’élongation des oligomères ................................................................................. 64
c) La modification des oligomères ............................................................................ 64
2. LES MACHINERIES ENZYMATIQUES .................................................................................. 65
a) Les chaines d’assemblage des composés PK ....................................................... 65
b) Les chaines d’assemblage des composés NRP .................................................... 70
c) Les chaines d’assemblages hybrides PKS-NRPS................................................ 75
d) Les modifications enzymatiques après la chaine d’assemblage ........................ 75
e) Les enzymes de réparation des chaines d’assemblage........................................ 75
f) Les domaines manquants et autres violations de colinéarité ............................. 75
g) Les fragments de chaine d’assemblage................................................................ 76
3. LA TAILLE DES CHAINES D’ASSEMBLAGE ......................................................................... 76
4. STRUCTURE DES CHAINES D’ASSEMBLAGE PKS ET NRPS............................................... 77
a) L’architecture modulaire...................................................................................... 77
b) Reconnaissance entre les sous-unités protéiques................................................ 79
c) Autres interactions................................................................................................. 80
C. FONCTIONS NATURELLES DES PK ET DES NRP ............................................................ 81
1. LA COLONISATION ........................................................................................................... 81
a) Armes de destruction massive ou molécules de signalisation ?......................... 81
b) La protection contre les prédateurs eucaryotes ................................................. 82
c) La mobilité, l’adhérence et la formation de biofilm ........................................... 82
d) La chélation du fer et des autres ions métalliques.............................................. 83
2. LA SYMBIOSE................................................................................................................... 85
3. LA VIRULENCE................................................................................................................. 85
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