Les plasmides pSci de Spiroplasma citri GII3 : caractérisation fonctionnelle et rôle dans la transmission par l'insecte vecteur, Plasmids pSci from Spiroplasma citri GII3 : functional characterization and role in insect transmission

Marc Breton

Description

Sous la direction de Joël Renaudin
Thèse soutenue le 11 décembre 2009: Bordeaux 2
Les plasmides pSci de Spiroplasma citri GII3 possèdent une structure mosaïque avec de nombreuses régions conservées. Des dérivés du plasmide pSci2 ont été produits par délétions successives et leur capacité de réplication a été évaluée. Le plus petit réplicon obtenu ne contient plus qu’une CDS (pE) et ses régions flanquantes. L’inactivation dans un vecteur navette du gène pE est suffisante pour abolir la réplication de ce plasmide dans S. citri. Des dérivés des pSci ont été introduits efficacement dans S. kunkelii et S. phoeniceum, deux spiroplasmes phytopathogènes pour lesquels aucun outil génétique n’était disponible jusqu’à présent. La stabilité des dérivés des pSci a également été évaluée par leur capacité à persister en l’absence de pression de sélection. L’instabilité ségrégationnelle des plasmides dans lesquels soj a été délété ou inactivé indique que la protéine de partition Soj/ParA est essentielle au maintien des plasmides pSci. L’incompatibilité sélective entre un plasmide pSci et ses dérivés a été exploitée pour produire une collection de souches possédant des profils plasmidiques différents. L’analyse des phénotypes d’acquisition et de transmission de plusieurs de ces mutants suggère que la CDS traG portée par le pSci6 est essentielle à la transmission de S. citri GII3. En revanche, les plasmides pSci1-5, codant les protéines adhésine-like ScARPs, ne sont indispensables ni à l’acquisition ni à la transmission. Dans le cadre de ce travail, plusieurs outils génétiques ont été adaptés aux mollicutes. Le promoteur Pxyl/tetO2 a été utilisé pour contrôler l’expression du gène de la spiraline chez S. citri et M. agalactiae. Enfin, un système de linéarisation de plasmide in vivo basé sur l’expression de l’endonucléase I-SceI a été utilisé pour l’élimination de plasmides pSci chez S. citri.
-Mollicute phytopathogène
-Spiroplasma citri
-Plasmides
-Réplication
-Partition
-Incompatibilité
-Transmission par insecte
-Expression inductible
Plasmids pSci from Spiroplasma citri GII3 display a mosaic gene organization with highly conserved regions. Through successive deletions, various pSci2 derivatives were constructed and assessed for their ability to replicate. The smallest functional replicon consists of one single CDS (pE) and its flanking, intergenic regions. Furthermore, shuttle (S. citri/E. coli) plasmids, in which the pE gene was disrupted, failed to replicate in S. citri, suggesting that PE is the replication protein. S. citri plasmids were efficiently introduced into S. kunkelii and S. phoeniceum, two plant pathogenic spiroplasmas, the transformation of which had never been described before. Studying stability of various pSci-derived plasmids in the absence of selection pressure strongly suggests the occurrence of an active partition system involving the soj-like gene. Selective incompatibility between a given pSci plasmid and its derivatives was used to remove plasmids from the wild-type strain. As a result, a collection of S. citri GII3 mutants differing in their plasmid contents was produced. Experimental transmission of these mutants through injection to or ingestion by the leafhopper vector will provide new insights into the role of plasmid encoded determinants in the biology of S. citri. First data indicated that pSci6 traG is required for insect transmission of S. citri GII3. In contrast, pSci1-5, encoding adhesin-like proteins, are not essential for both transmission and acquisition. In the frame of this work, new genetic tools have been adapted for use in mollicutes. The tetracycline inducible promoter, Pxyl/tetO2, was used to control spiraline gene in S. citri and M. agalactiae. Also, an in vivo linearization system based on the expression of the I-SceI-endonuclease was used to remove pSci plasmids from S. citri.
-Plant pathogenic mollicute
-Spiroplasma citri
-Plasmids
-Replication
-Partition
-Incompatibility
-Insect transmission
-Inducible expression
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21673/document

Sujets

• Plasmide
• Réplication

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 73
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

Université Victor Segalen Bordeaux 2


Année 2009

Thèse n°1673

THÈSE

pour le

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2

Mention : Sciences, Technologie, Santé
Option : Microbiologie


Présentée et soutenue publiquement

Le 11 décembre 2009

Par Marc Breton

Né le 14 novembre 1979 à Périgueux (Dordogne)


Les plasmides pSci de Spiroplasma citri GII3 : caractérisation
fonctionnelle et rôle dans la transmission par l’insecte vecteur




Membres du Jury

M. BLANCHARD A., Professeur à l’Université de Bordeaux 2 ........... Président
M. BLANCO C., Professeur à l’Université de Rennes 1 ........................ Rapporteur
Mme CITTI C., Directrice de Recherche à l’INRA de Toulouse ........... Raur
Mme QUENTIN-NOURY C., Professeur à l’Université de Bordeaux 2 Examinateur
M. MANCEAU C., Directeur de Recherche à l’INRA d’Angers ........... Examinateur
M. RENAUDIN J., Directeur de Recherche à l’INRA de Bordeaux ...... Directeur de thèse


























A ma femme, à mes enfants
















Ce travail a été réalisé au sein de l’équipe Mollicutes de l’Unité Mixte de Recherche
Génomique, Développement et Pouvoir Pathogène (Institut National de la Recherche
Agronomique et Université Victor Ségalen Bordeaux 2) dirigée par le Professeur Alain
Blanchard.

Je remercie tout d’abord Joël Renaudin de m’avoir accueilli dans son laboratoire et
d’avoir assuré la direction de ma thèse. Je tiens à lui témoigner toute ma reconnaissance
pour la qualité de son encadrement mais également la disponibilité et la compréhension dont
il a toujours fait preuve à mon égard.

Je remercie le Professeur Alain Blanchard de me faire l’honneur de présider ce Jury.

J’exprime toute ma gratitude au Pr Carlos Blanco et au Dr Christine Citti pour avoir
accepté d’examiner et de juger cette thèse.

Je remercie également le Pr Claudine Quentin-Noury et le Dr Charles Manceau de
participer à ce jury.

Je tiens à remercier vivement tous les membres de l’équipe mollicutes qui m’ont
accompagné au cours de cette thèse et tout particulièrement Sybille Duret, Jean-Luc Danet et
Pascal Sirand-Pugnet qui ont largement contribué à ce travail.

Mes remerciements vont également à mon épouse qui accomplit l’exploit de supporter
un thésard à ses côtés pendant ces années.














TABLES DES MATIERES

I. INTRODUCTION ............................................................................................................ 11
A) Mollicutes ..................... 11
1. Taxonomie .................... 11
2. Phylogénie ................................................................................................ 14
3. Les mollicutes phytopathogènes .................................................. 16
a) Les spiroplasmes phytopathogènes .......... 17
(1) Spiroplasma citri ................................................................................................ 17
(a) Maladie du stubborn des agrumes et découverte de S. citri ........................... 17
(b) Cycle biologique ............................. 17
(c) Caractéristiques de S. citri .............................................................................. 21
(d) Déterminants génétiques de la transmission de S. citri .. 22
(i) La spiraline .................................................................................................. 22
(ii) La protéine Sc76 ......................... 22
(iii) Les protéines codées par les plasmides pSci1-6 ........ 23
(2) Les autres spiroplasmes phytopathogènes : S. kunkelii et S. phoeniceum .......... 23
b) Les phytoplasmes ..................................................................................................... 23
B) Eléments génétiques mobiles ....................... 25
1. Généralités .................................................................................................................... 25
2. Eléments mobiles et transposables dans la classe des Mollicutes ................................ 26
a) Séquences d’insertions ............................. 26
(1) Généralités sur les séquences d’insertion ........................................................... 26
(2) Caractéristiques des séquences d’insertion de mollicutes .................................. 27
(3) Séquences d’insertion dans les génomes séquencés de mollicutes .................... 31
b) ICE ........................................................................................... 34
(1) Généralités sur les ICE ....................................................... 34
(2) Caractéristiques des ICE de mollicutes .............................. 35
(3) ICE présents dans les génomes séquencés de mollicutes ................................... 36
c) SVM et PMU ............................................................................ 37
(1) Caractéristiques des SVM/PMU ......... 37
(2) PMU présents dans les génomes de phytoplasmes ............................................. 38
(a) ‘Ca. P. asteris’ AY-WB .................................................. 38
(b) Phytoplasme de l’Onion Yellows (OY) .......................................................... 39
(c) ’Candidatus phytoplasma mali’ ...................................... 39
(d) us phytoplasma australiense’ 39
d) Bactériophages et prophages .................................................................................... 39
(1) Généralités sur les bactériophages ...... 39
(2) Caractéristiques des virus de mollicutes ............................. 40
(3) Principaux virus de mollicutes séquencés .......................................................... 41

(a) Mycoplasma pulmonis virus P1 (Podoviridae) ............................................... 41
(b) Mycoplasma arthritidis MAV1 ...................................... 41
(c) SpV1 (Inoviridae) ........................................................... 42
(d) SVTS2 (Inoviridae) ........................................................ 43
(e) SpV4 (Microviridae) ....................... 44
e) Plasmides .................................................................................. 45
(1) Généralités sur les plasmides .............................................. 45
(a) Définition ........................................................................ 45
(b) Réplication ...... 46
(i) Théta ............................................ 46
(ii) Cercle roulant ............................................................................................. 47
(c) Contrôle du nombre de copie .......... 47
(d) Stabilisation .................................... 48
(i) Résolution des multimères .......................................... 48
(ii) Systèmes de partition actifs ........ 49
(iii) Toxine-antitoxine ...................................................... 52
(e) Incompatibilité ................................................................ 52
(i) Incompatibilité liée à la réplication ............................. 53
(ii) Incli à la partition ................................ 53
(f) Conjugaison et mobilisation ............................................ 54
(2) Caractéristiques des plasmides de mollicutes ..................... 56
(3) Plasmides séquencés chez les mollicutes ........................................................... 56
(a) Plasmides de mycoplasmes ............................................. 56
(b) Plasmides de phytoplasmes ............................................ 57
(c) Plasmides de spiroplasmes .............. 59
(i) Caractéristiques générales ........... 59
(ii) Plasmides de Spiroplasma citri GII3.......................................................... 59
(iii) Plasmides pSci et cycle infectieux ............................ 62
C) Objectifs des recherches et présentation da la thèse .................... 63
II. RESULTATS .................................................................................................................. 64
A) Réplication et stabilité des plasmides pSci .................................................................. 64
1. Réplication du pSci2 .................................... 64
a) Identification de la région de r&