Mapping the human interactome by BAC transgeneOmics and quantitative mass spectrometry [Elektronische Ressource] / Nina Christa Hubner

Hubner

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 18
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 13 Mo

Extrait

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN

- Lehrstuhl für Proteomik -


Mapping the Human Interactome by BAC
TransgeneOmics and Quantitative Mass Spectrometry


Nina Christa Hubner



Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung,
Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen
Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigten Dissertation.


Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. Harun Parlar
Prüfer der Dissertation:
1. apl. Prof. Dr. Angelika Görg, i.R.
2. apl. Prof. Dr. Matthias Mann
(Ludwig-Maximilians-Universität München)
3. Univ.-Prof. Dr. Bernhard Küster

Die Dissertation wurde am 09.09.2010 bei der Technischen Universität München eingereicht und
durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt
am 20.10.2010 angenommen.















Für meine lieben Eltern
Christa und Alfred Hubner

Table of Contents

Table of Contents
TABLE OF CONTENTS 1
GERMAN SUMMARY 3
PROLOGUE 7
INTRODUCTION 9
1. PROTEIN IDENTIFICATION BY MS SHOTGUN PROTEOMICS 9
2. QUANTITATIVE PROTEOMICS 10
3. BIOINFORMATIC ANALYSIS OF PROTEOMICS DATA 16
RESULTS 21
1. COMPREHENSIVE PROTEOME ANALYSIS 21
1.1 PEPTIDE SEPARATION WITH IMMOBILIZED PI STRIPS IS AN ATTRACTIVE ALTERNATIVE TO IN-GEL PROTEIN DIGESTION FOR
PROTEOME ANALYSIS 21
1.2 STABLE ISOTOPE LABELING BY AMINO ACIDS IN CELL CULTURE (SILAC) AND PROTEOME QUANTITATION OF MOUSE
EMBRYONIC STEM CELLS TO A DEPTH OF 5,111 PROTEINS 26
1.3 COMPREHENSIVE MASS-SPECTROMETRY-BASED PROTEOME QUANTIFICATION OF HAPLOID VERSUS DIPLOID YEAST 29
2. INTERACTION PROTEOMICS 32
2.1 QUANTITATIVE PROTEOMICS COMBINED WITH BAC TRANSGENEOMICS REVEALS IN VIVO PROTEIN INTERACTIONS 34
2.2 QUBIC AS THE BASIS FOR A HUMAN INTERACTION PROTEOME 41
2.3 LOOKING AT PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS IN A SPECIFIC CONTEXT: THE X-LINKED MENTAL RETARDATION
INTERACTION NETWORK 49
CONCLUDING REMARKS AND PERSPECTIVES 57
REFERENCES 59
ABBREVIATIONS 69
ACKNOWLEDGEMENTS 71

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Table of Contents


APPENDIX 75
APPENDIX 1: PEPTIDE SEPARATION WITH IMMOBILIZED PI STRIPS IS AN ATTRACTIVE ALTERNATIVE TO IN-GEL PROTEIN
DIGESTION FOR PROTEOME ANALYSIS 78
APPENDIX 2: HOW MUCH PEPTIDE SEQUENCE INFORMATION IS CONTAINED IN ION TRAP TANDEM MASS SPECTRA? 91
APPENDIX 3: STABLE ISOTOPE LABELING BY AMINO ACIDS IN CELL CULTURE (SILAC) AND PROTEOME QUANTITATION OF
MOUSE EMBRYONIC STEM CELLS TO A DEPTH OF 5,111 PROTEINS 97
APPENDIX 4: COMPREHENSIVE MASS-SPECTROMETRY-BASED PROTEOME QUANTIFICATION OF HAPLOID VERSUS DIPLOID
YEAST 115
APPENDIX 5: HIGH CONFIDENCE DETERMINATION OF SPECIFIC PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS USING QUANTITATIVE
MASS SPECTROMETRY 123
APPENDIX 6: QUANTITATIVE PROTEOMICS COMBINED WITH BAC TRANSGENEOMICS REVEALS IN-VIVO PROTEIN
INTERACTIONS 133
APPENDIX 7: EXTRACTING GENE FUNCTION FROM PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS USING QUANTITATIVE BAC
INTERACTOMICS (QUBIC) 151
APPENDIX 8: USE OF PUBLIC GENE TRAP RESOURCES FOR HIGH THROUGHPUT PROTEOME ANALYSIS 161
APPENDIX 9: CURRICULUM VITAE (CV) 167



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German summary

German summary
Das umfassenden Verständnis komplexer biologischer Systeme setzt die
Identifikation und funktionelle Charkterisierung seiner Schlüsselkomponenten
voraus. Umfassende Analysen auf globalem, systemweiten Level wurden erstmals
auf dem Gebiet der Genetik durchgeführt. Ein großer Meilenstein war
beispielsweise die Veröffentlichung des kompletten humanen Genoms im Jahr
2001 (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001). In den folgenden Jahren wurde es
allerdings zunehmend klar, dass die Analyse von statischen Genomen alleine nicht
ausreicht, um die vollständige Biologie einer Säugerzelle zu begreifen. Das
Grundverständnis zellulärer Funktionen verlangt die Quantifizierung globaler
mRNA und Proteinmengen inklusive ihrer post-translationalen Modifikationen
und Protein-Protein-Wechselwirkungen. Obwohl jede dieser Fragen heute mittels
unabhängiger, isolierter Techniken beantwortet werden kann, ist die Integration
all dieser Daten und Ergebnisse notwendig um dem Ziel des gläsernen
menschlichen Körpers näher zu kommen.
Diese Doktorarbeit trägt ein kleines Stück zum Erreichen dieses ultimativen
Ziels bei. Während meiner Forschungsarbeiten im Labor von Prof. Mann arbeitete
ich an der Entwicklung neuer Ansätze und Technologien in zwei Teilgebieten der
auf Massenspektrometrie basierenden Proteomik: Die umfassende Analyse aller
Proteine einer Zelle oder Organismus und die zuverlässige Identifizierung von
Protein-Protein-Wechselwirkungen. Zunächst etablierte ich eine neue
Separierungsmethode für Peptidmixturen namens OFFGEL (Hubner et al., 2008)
die dazu dient, die Komplexität der Einzelproben vor der massenspektrometrische
Analyse zu reduzieren. OFFGEL basiert auf isoelektrischer Fokussierung von
Peptiden mittels immobilsierten pH-Gradienten (IPG), einer Methode die auf
Proteinlevel in der 2D-Gelelektrophorese Anwendung findet. Vorteil gegenüber
vorhergehenden Peptidseparierungsmethoden mittels IPGs ist, dass die Peptide
direkt nach ihrer Fokussierung wieder in Lösung gehen und so aufwendige

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German summary

Extrahierungsstrategien, die mit großen Verlusten verbunden sind, umgangen
werden können. Diese Methode wendete ich auch an, um möglichst viele Proteine
in Hefe zu identifizieren und erreichte eine Proteomtiefe sehr ähnlich zu
herkömmlichen, wesentlich aufwändigeren Separierungsmethoden (Fraktionierung
in zelluläre Untereinheiten und anschließende Separierung auf SDS-Gelen). Diese
Messungen trugen auch zur ersten Quantifizierung des kompletten Hefeproteoms
bei, eine Leistung die von der Zeitschrift Science als eine der 10 wissenschaftlichen
Druchbrüche im Jahr 2008 tituliert wurde (de Godoy et al., 2008). Zusätzlich zu
diesen Entwicklungen etablierte ich SILAC (stable isotope labeling of amino acids
in cell culture) für embryonale Stammzellen aus Maus (Graumann et al., 2008).
Die SILAC Technik ist eine gängige Methode in auf Massenspektrometrie
basierender Proteomik um Proteinmengen aus Zellen, die zum Beispiel
unterschiedlich behandelt wurden, quantitativ zu Vergleichen. Zellen werden dabei
12 14 13 15mit Arginin und Lysin, die unterschiedliche Isotope (C N oder C N ) enthalten
kultiviert. Dies erfordert spezielle Kulturbedingungen, beispielsweise dialysiertes
Serum, und aus diesem Grund war die Anwendung von SILAC für embryonale
Stammzellen, die zu dieser Zeit noch nicht trivial zu kultivieren waren, eine große
Herausforderung. In Zusammenarbeit mit Dr. Johannes Graumann quantifizierte
ich 5,111 Proteine in embryonalen Stammzellen aus Maus. Dies stellte zu jener
Zeit das umfassendste Proteom überhaupt dar.
Der Hauptteil meiner Arbeit beschäftigt sich mit der Identifizierung von Protein-
Protein Wechselwirkungen, im Besonderen auch in Abhängigkeit von zellulären
Zuständen oder Behandlungen, beispielsweise mit Kinaseinhibitoren. Er basiert
auf einer engen Zusammenarbeit mit Prof. Anthony Hyman am Max-Planck
Institut in Dresden, Deutschland. Gene in voller Länge (inklusive Introns und
beispielsweise Promoterregionen) werden dort mittels BAC TransgeneOmics mit
dem grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert (getagged) und HeLa Zellen
stabil mit dem Konstrukt transfiziert. Das entsprechende Protein wird in diesen
Zellen nun auf endogenem Level exprimiert, natürlich prozessiert (Splicing,

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German summary

posttranslationale Modifikationen) und ist an GFP gekoppelt. Herkömmliche
Methoden verwenden getaggte cDNA, die nicht zelltypspezifisch prozessiert und
vor allem meist überexprimiert wird. Dies führt häufig dazu, dass sich das Protein
nicht natürlich verhält und oft auch nicht mit den korrekten Proteinen
wechselwirkt. Wir verwenden nun diese BAC transgenen Zelllinien aus Dresden
um das getaggte Proteinen inklusive seiner Bindungspartner mittels einem
Antikörper gegen GFP, der an magnetische Partikel gekoppelt ist, aus dem
Zelllysat anzureichern. Die angereicherten Proteine werden anschließend mittels
Massenspektrometrie identifiziert. Wir verwenden hierfür einen quantitative
Methode in From von SILAC oder ‚label-free‘ Proteinquantifizierung (letzteres
beruht auf einem neuen Algorithmus, der in unserem Labor entwickelt wurde) um
unsere Aufreinigungen mit Kontrollaufreinigungen zu vergleichen und so
spezifische Wechselwirkungspartner von dem großen Überschuss an Proteinen, die
unspezifisch an die Affinitätsmatrix binden, zu unterscheiden. Wir nannten diese