Mechanisms of energy transfer and conversion in plant light harvesting complex II [Elektronische Ressource] / von Tiago Ferreira de Barros

Tiago Barros

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• Publié par: goethe_universitat_frankfurt_am_main
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 14
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 17 Mo

Extrait

Mechanisms of energy transfer and conversion in
plant Light-Harvesting Complex II

Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften


vorgelegt beim Fachbereich 14
Biochemie, Chemie und Pharmazie
der Johann Wolfgang Goethe - Universität
in Frankfurt am Main


von
Tiago Ferreira de Barros
aus Porto, Portugal

Frankfurt 2009













Vom Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der Johann Wolfgang
Goethe-Universität als Dissertation angenommen.



Dekan: Prof. Dr. Dieter Steinhilber
1. Gutachter: Prof. Dr. B. Ludwig
2. Gutachter: Prof. Dr. W. Kühlbrandt

Datum der Disputation:









To my grandfather F. A. de Barros.

ZUSAMMENFASSUNG
Der Lichtsammelkomplex des Photosystems II (light-harvesting complex II,
LHC-II) stellt den Hauptantennenkomplex in der pflanzlichen Photosynthese dar.
Dieser macht ungefähr 30% des gesamten Proteingehalts in pflanzlichen
Chloroplasten aus, weshalb er das quantitativ meist verbreitete Membranprotein
auf der Erde sein dürfte. Etwa die Hälfte des pflanzlichen Chlorophylls (Chl) wird
durch ihn gebunden. Der Komplex liegt als Trimer in der Thylakoidmembran vor
und bindet insgesamt 54 Pigmentmoleküle: 24 Chl a, 18 Chl b, 6 Luteine (Lut), 3
Neoxanthin- (Neo) und 3 Violaxanthinmoleküle (Vio).
LHC-II fallen fünf Schlüsselrollen in der pflanzlichen Photosynthese zu: (1)
Sammeln von Sonnenlicht und Weiterleitung der Anregungsenergie an die
Reaktionszentren der Photosysteme I und II, (2) Regulierung der Menge an
Anregungsenergie, welche beide Photosysteme erreicht, (3) Stabilisierung der
Architektur der photosynthetischen Superkomplexe, (4) Beitrag zur dichten
Packung der Grana-Thylakoidstapel in Chloroplasten und (5) Schutz des
Photosyntheseapparates vor Lichtschäden durch die nicht-photochemische
Löschung der Anregungsenergie (non-photochemical quenching, NPQ).
Einen großen Anteil am NPQ besitzt die energieabhängige Komponente qE.
Obwohl ihre Notwendigkeit für das Überleben der Pflanze bekannt ist und die
zugrunde liegenden Prozesse jahrzehntelang erforscht wurden, sind die exakten
Mechanismen des Abführens von absorbierter Lichtenergie unter qE-Bedingungen
weitgehend unbekannt. Es gilt als gesichert, dass qE durch den pH-Gradienten über
die Thylakoidmembran reguliert wird. Weiterhin ist bekannt, dass infolge des pH-
Abfalls im Thylakoidlumen unter Starklichtbedingungen das Enzym Violaxanthin-
De-epoxidase (VDE) aktiviert wird, welches im Xanthophyllzyklus das Carotinoid
Vio in Zeaxanthin (Zea) umwandelt. Desweiteren zeigten Studien an Arabidopsis
Mutanten, dass PsbS, eine Untereinheit des Photosystems II, essentiell für qE ist.
Inwiefern diese physiologischen Prozesse jedoch dazu beitragen, dass LHC-II von
einem aktiven, Energie transferierenden, in einen Energie abführenden Zustand
versetzt wird, in welchem Sonnenenergie nicht an die Photosysteme weitergeleitet,
sondern in Wärme umgewandelt wird, ist ungeklärt und Gegenstand dieser Arbeit.
I
Das Abführen überschüssiger Anregungsenergie in vivo steht mit einer
Fluoreszenzlöschung von LHC-II in vitro im Zusammenhang. Deshalb ist es
möglich, den qE zugrunde liegenden Mechanismus anhand der Prozesse zu
untersuchen, die eine Änderung der Fluoreszenzeigenschaften von LHC-II
bewirken. Dementsprechend war ein Großteil der experimentellen Arbeit der
spektroskopischen Charakterisierung von LHC-II-Präparationen mit veränderter
Pigmentkomposition gewidmet. Die Rolle spezieller Chl-Paare in der
Fluoreszenzlöschung wurde mittels stationärer Fluoreszenzspektroskopie von
rückgefalteten LHC-II-Mutanten analysiert. Um die Funktion von Zea aufzuklären,
wurden drei Methoden zur Gewinnung von Zea-angereichertem LHC-II
entwickelt: (1) die Isolierung von LHC-II aus der Arabidopsis-Mutante npq2, welche
in der Synthese von Vio blockiert ist und Zea akkumuliert, (2) die Isolierung von
LHC-II aus Spinat- und Erbsenthylakoidmembranen, deren vorausgehende
Behandlung einen in vitro Xanthophyllzyklus auslöste und (3) die Inkubation von
rückgefaltetem LHC-II mit solubilisiertem Zea. Aus der Arabidopsis-Mutante npq2
gereinigtem LHC-II fehlte Neo und der Komplex wurde hauptsächlich als
Monomer isoliert. Der Fortschritt in der Etablierung von Wachstumsbedingungen
für Arabidopsis Pflanzen in Hydrokulturen erlaubte jedoch die Reinigung von sehr
reinem, trimeren LHC-II aus WT Pflanzen. Mit Hilfe der anderen beiden
Strategien wurden Zea-angereicherte LHC-II Proben gewonnen, welche per
transienter Absorptionsspektroskopie, sowie zeitaufgelöster Fluoreszenz- und
Zweiphotonenanregungsspektroskopie, analysiert wurden. Innerhalb des
Themengebiets „Xanthophyllzyklus“ wurde zusätzlich ein Expressions- und
Reinigungsprotokoll für VDE aus Arabidopsis etabliert, welches künftige Arbeiten
zur Strukturbestimmung dieses Enzyms ermöglicht.
Nach dem Erhalt der hochaufgelösten Röntgenstrukturen von LHC-II aus
Erbse und Spinat wurde die kritische Frage aufgeworfen, ob diese Strukturen den
Energie transferierenden oder den Energie abführenden Zustand des Komplexes
zeigen. Um diese Frage zu beantworten, ist ein Großteil dieser Arbeit der ersten
detaillierten spektroskopischen Einzelkristallanalyse von LHC-II gewidmet. Dies
erforderte nicht nur ein hochmodernes System zur Spektroskopie von
Einzelkristallen, welches an der Cryobench der Europäischen Synchrotron
Strahlungsanlage (ESRF, Grenoble, Frankreich) zur Verfügung stand, sondern
II
auch zahlreiche Kristallisationsansätze zur Reproduktion der Kristalle, die für die
Strukturbestimmungen verwendet worden waren.
Aus den Ergebnissen, die im Laufe dieser Doktorarbeit erhalten wurden,
lassen sich fünf wesentliche Schlussfolgerungen in Bezug auf qE ableiten:
1. Der Austausch von Vio gegen Zea in LHC-II ist für ein effizientes
Abführen von überschüssiger Anregungsenergie nicht ausreichend. Gemäß dem Modell
des “Schaltungsmechanismus” (gear-shift mechanism) für qE induziert ein Austausch
von Vio gegen Zea in LHC-II ein Umschalten in den Energie löschenden Zustand.
LHC-II Proben mit oder ohne Zea wurden mittels einer Reihe spektroskopischer
Methoden verglichen. Der Austausch von Vio gegen Zea zeigte keine signifikante
Auswirkung auf die Lebensdauer des angeregten Zustands von LHC-II, was
sowohl anhand transienter Absorptionskinetiken des angeregten Chl-Zustands, als
auch anhand zeitaufgelöster Fluoreszenz, gezeigt werden konnte. Dies impliziert,
dass der einfache Austausch dieser beiden Carotinoide gegeneinander nicht
ausreicht, um ein effizientes Abführen überschüssiger Anregungsenergie in der
Thylakoidmembran unter Starklichtbedingungen zu gewährleisten.
2. Energielöschung infolge von LHC-II Aggregation benötigt weder Vio und
Neo, noch ein spezielles Chl-Paar. Es ist bekannt, dass die Energielöschung infolge
der Aggregation von LHC-II einige spektroskopische Ähnlichkeiten mit qE
aufweist, weshalb ein mechanistischer Zusammenhang vermutet wird. Die
Aggregation von rückgefalteten LHC-II-Mutanten, welchen einzelne Chlorophylle
fehlen, resultierte in derselben ~100-fachen Reduktion der Fluoreszenzausbeute,
welche für den WT beobachtet wurde. Hierdurch wurde nachgewiesen, dass keines
der vier potentiell energielöschenden Chl-Dimere im LHC-II-Monomer zur
Energielöschung benötig wird. Der ΔChl 13 Mutante fehlten zusätzlich Neo und
Vio. Dennoch zeigte sie nach Aggregation eine vom WT ununterscheidbare
Energielöschung, wodurch ausgeschlossen werden kann, dass diesen beiden
Carotinoiden in der Energielöschung durch Aggregation eine Bedeutung zukommt.
3. Mit einer Ausnahme ist die Pigmentstruktur in LHC-II starr. Seit
langem hält sich die Hypothese einer Konformationsänderung von LHC-II als
mechanistische Erklärung für qE, obwohl bislang kein überzeugender struktureller
III
Beweis erbracht wurde. Spektroskopische Daten suggerieren, dass mit dieser
hypothetischen Konformationsänderung ein Twist in der Neo-Konfiguration unter
qE-Bedingungen einhergeht. Eine Analyse der B-Faktorverteilung beider
Röntgenstrukturen von LHC-II ist in dieser Arbeit dargelegt. Sie zeigt, dass das
Innere des Komplexes, in welchem sich die mit der Energielöschung in
Zusammenhang gebrachten Pigmente befinden, starr und nur der in die Lipidphase
der Thylakoidmembran ragende Teil von Neo flexibel ist. Der Twist von Neo
scheint daher nicht die Folge einer Konformationsänderung zu sein, sondern auf
eine Interaktion zwischen LHC-II und einem anderen Makromolekül hinzuweisen.
4. Beide Röntgenstrukturen von LHC-II zeigen denselben Energie
abführenden Zustand des Komplexes. Aufgrund einer offensichtlichen
Rotverschiebung des Fluoreszenz-Emissionsmax