cours MECB

Paillard

Description

Cross-linking et méthodes utilisant le cross-linkingCross-linking = établissement d’un pontage covalent entre 2 moléculesCes molécules pouvaient être en interaction « faible »(forces électrostatiques, interaction hydrophobe...),ou dans certains cas simplement à proximité l’une de l’autreMolécules pouvant être cross-linkéesProtéine-protéineProtéine-acide nucléiqueAcide nucléique-acide nucléiqueCross-link protéine-protéineUtilisation d’agent chimique. Exemple 1, imidoester bifonctionnelCross-link protéine-protéineUtilisation d’agent chimique. Exemple 2, DSP(=dithiobis(succinimidyl propionate) = réactif de Lomant)N-hydroxysuccinimide (NHS) à chaque extrémité réagit avec les amines primairesAvantage, le pont disulfure (le même réactif existe aussi sans pont disulfure=DSS)Exemple d’application de cross-link protéine-protéineFIG. 2. Identification of RNA-dependent AUF1 oligomers by protein-protein cross-linking. Bindingreactions containing His6- p37AUF1-(1–257) (5 mM) in the presence or absence of an unlabeled RNA substrate (1.5 mM) were cross-linked with DSP and fractionated by non-reducing SDS-PAGE as described under “Experimental Procedures.” Covalently linked complexes containing AUF1 were thenidentified by immunoblot. The migration positions of protein standards are shown at left.Wilson et al1999 JBC 274, 33374Limites du cross-link protéine-protéineLa réaction de cross-link n’est pas toujours très bien contrôlée.. ...

Informations

• Publié par: Phyan
• Nombre de lectures: 199
• Langue: English

Extrait

Cross-linkinget méthodes utilisant le cross-linking Cross-linking= établissement d’un pontagec ovalententre 2 molécules Ces molécules pouvaient être en interaction «faible» (forces électrostatiques, interaction hydrophobe...), ou dans certains cas simplement àproximitél’une de l’utare

Molécules pouvant être cross-linkées Protéine-protéine Protéine-acidenucléique Acide nucléique-acidenucléique

Cross-linkprotéine-protéine Utilisation d’agent chimique. Exemple 1, imidoesterbiofnctionnel

Cross-linkprotéine-protéine Utilisation (   = d d ’ it a hi g o e b n i t s   ( c s h u i c m c i i q ni u m e. i   d E y x l e pr m o p p l i e o   n 2, a   t D e) S  = P  réactif de Lomant) N-hydroxysuccinimide(NHS) àchaque extrémitéréagit avec les amines primaires Avantage, le pont disulfure(le même réactif existe aussi sans pont disulfure=DSS)

Exemple d’application de cross-linkprotéine-protéine FIG. 2. Identification ofRNA-dependentAUF1 oligomersby protein-proteincross-linking. Binding reactionscontainingHis6-p37AUF1-(1–257) (5 mM) in thepresenceor absence ofan unlabeledRNA substrate(1.5 mM) werecross-linkedwithDSP andfractionatedby non-reducingSDS-PAGE as describedunder“ExperimentalProcedures.”Covalentlynlikedcomplexes containingAUF1 werethen identifiedby immunoblot. Themigration positions ofproteinstandards are shownatleft.

Limites du cross-linkprotéine-protéine La réaction de cross-linkn’est pas toujours très bein contrôlée... Typiquement, le cross-linkpeut se produire entre des molécules qui sont simplement àproximitél’une de l’autre

Cross-linkprotéine-acidenucléique 1. Utilisation d’agent chimique : formaldehyde ARN ou ADN Rendement élevé, pontage réversible (par chauffage)

Cross-linkprotéine-acidenucléique 2. Irradiation aux UV Exemple : U   t v il o i i s r a  T bl D e     2 é   g (c a r le os m s e -l n in t  k po A u R r  N d - e d s c  i p n 1 t   e o r u a   c e ti I o F n 4 s F   ) ADN-protéine Rendement plus faible, pontage irréversible Mais cross-linksouvent plus spécifique (interacteursréels)

Cross-linkacide nucléique-acidenucléique Incubation en présence de psoralen(agent intercalant), puis irradiation UV (le psoralen ponte les pyrimidines de deux brins d’AN différents) (Utilisation médicale : psoriasis, eczéma photosensibilisation de la peau puis traitement UVA)

Exemple d’application du cross-linkARN-ARN Purification des complexes spliceosomaux, puis fractionnement par centrifugation sur gradient de saccharose

Exemple d’application du cross-linkARN-ARN Fig. 3. CharacterizationofRNA–RNA interactions in gradient-fractionatedspliceosomalcomplexes by psoralencrosslinking. Affinity-selectedcomplexes werefractionatedon a 10–30% glycerolgradient, andcrosslinkingwasperformedwitheven-numberedgradient fractions (as indicatedaboveeach lane) or 2% ofunfractionatedeluate(E lanes). In theleft-mostE lane, theeluatewasUV-irradiatedin theabsence ofpsoralento control for nonspecificcrosslinking. RNA wastransferredto a nylon membrane thatwashybridizedsequentiallywith32P-labeled probes specificfor pre-mRNA(A) U2 snRNA(B) andU1 snRNA(C). Theidentityofthecrosslinkedspeciesisindicatedon theright. AMT, psoralen; PRE, pre-mRNA; intPRE, internallycrosslinkedpre-mRNA.