Etude pharmacologique de la voie de signalisation impliquée dans l

Etude pharmacologique de la voie de signalisation impliquée dans l'apoptose des péricytes rétiniens

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CONCLUSIONS / PERSPECTIVES 183 184 Une des altØrations caractØristiques de la rØtinopathie diabØtique est la disparition prØcoce des pØricytes, massivement prØsents dans les microvaisseaux rØtiniens. Plusieurs Øtudes suggŁrent aujourd hui que les pØricytes disparaissent par un phØnomŁne d apoptose. Mais les agents inducteurs d un tel processus ainsi que les voies intracellulaires sous-jacentes n ont pas ØtØ clairement identifiØs in vivo. Ce travail de thŁse a permis de montrer d une part que les produits avancØs de glycation, dØrivØs du mØthylglyoxal, induisent in vitro l apoptose des pØricytes et d autre part d identifier de nouveaux acteurs molØculaires impliquØs dans la transduction du message apoptotique. Nous avons mis en Øvidence que l apoptose des pØricytes rØtiniens induite par les AGE-MGX, est gouvernØe par l activation de diffØrentes caspases, la production de diacylglycØrols (DAG) et de cØramides, et l induction d un stress oxydant. Dans nos conditions de culture, ces modifications biochimiques ne sont induites que par les AGE dans les pØricytes rØtiniens puisque de fortes concentrations en glucose n ont affectØ ni la mort cellulaire, ni les niveaux endogŁnes des DAG et des cØramides. Les pØricytes semblent Œtre plus sensibles aux AGE qu une forte concentration en glucose, pour une mŒme durØe de ...

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CONCLUSIONS / PERSPECTIVES
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Une des altérations caractéristiques de la rétinopathie diabétique est la disparition précoce des péricytes, massivement présents dans les microvaisseaux rétiniens. Plusieurs études suggèrent aujourdhui que les péricytes disparaissent par un phénomène dapoptose. Mais les agents inducteurs dun tel processus ainsi que les voies intracellulaires sous-jacentes nont pas été clairement identifiésin vivo. Ce travail de thèse a permis de montrer dune part que les produits avancés de glycation, dérivés du méthylglyoxal, induisentin vitrolapoptose des péricytes et dautre part didentifier de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la transduction du message apoptotique. Nous avons mis en évidence que lapoptose des péricytes rétiniens induite par les AGE-MGX, est gouvernée par lactivation de différentes caspases, la production de diacylglycérols (DAG) et de céramides, et linduction dun stress oxydant. Dans nos conditions de culture, ces modifications biochimiques ne sont induites que par les AGE dans les péricytes rétiniens puisque de fortes concentrations en glucose nont affecté ni la mort cellulaire, ni les niveaux endogènes des DAG et des céramides. Les péricytes semblent être plus sensibles aux AGE quà une forte concentration en glucose, pour
une même durée de traitement. Linduction de lapoptose par les AGE dans les péricytes rétiniens pourrait être reliée à la situation pathologique observéein vivo. Les péricytes sont enfouis dans la membrane basale, constituée de protéines de structures comme le collagène IV et la fibronectine, capables de générer des AGE très tôt au cours du diabète, avant même la formation de capillaires acellulaires, et qui saccumulent progressivement pendant la maladie (Stittet al.,1997). Les AGE circulants transportés vers lespace subendothélial à travers lendothélium contribuent également à laccumulation dAGE dans la membrane basale et dans les péricytes rétiniens (Sttitet al.,et 2000a). Par ailleurs des agents anti-glyquants comme 1997 laminoguanidine ou lOPB-9195 préviennent la disparition des péricytes (Hammeset al.,1991; Yatohet al., 2001) et laccumulation dAGE dans la rétine (Hammeset al., 1991) de rats diabétiques. Leffet des AGE sur les péricytes rétiniens et leur mécanisme daction décritsin vitro, pourraient être examinésin vivoadministrant des AGE par voie en intraveineuse à des rats normo-glycémiques, selon le protocole proposé par Stitt et al (2000b), en purifiant ensuite les microvaisseaux rétiniens (par un choc osmotique, par exemple) et en observant lapoptose dans les péricytes rétiniensex vivo ainsi que linduction des différents médiateurs intracellulaires identifiés. Limplication réelle des acteurs moléculaires décrits dans lapoptose des péricytes bovins, notamment la caspase-10, pourrait également être examinéeex vivodes péricytes de rétines humaines, prélevées dans postmortemdes sur patients diabétiques et à partir desquelles larbre vasculaire est purifié. La présence et lactivation de caspases, comme la caspase-10, pourrait être mise en évidence, par exemple,
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par des techniques dimmunoempreintes (Western Blot), permettant de visualiser la protéine clivée, ou dELISA de capture au moyen danticorps spécifiques, permettant de purifier la caspase active et de mesurer lactivité enzymatique.Après avoir mis en évidence que les AGE peuvent induire spécifiquement l'apoptose dans les péricytes rétiniens, nous avons entrepris détudier la voie de signalisation intracellulaire menant à lapoptose. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux voies de formation des DAG et des céramides. Lutilisation dinhibiteurs enzymatiques nous a permis dune part dexclure limplication de la voie de biosynthèsede novodes céramides et dautre part de montrer que les DAG sont produits par la PC-PLC et sont couplés à lactivation séquentielle de lA-SMase pour générer les céramides. Afin de confirmer lactivation de ces enzymes, nous aurions pu réaliser différents contrôles, comme un dosage des substrats à partir desquels sont produits les DAG et les céramides (respectivement les phosphatidylcholines et les sphingomyélines) par des méthodes de marquages métaboliques et/ou mesurer les activités des enzymes produisant ces médiateurs lipidiques dans les péricytes soumis aux AGE-MGX. Une autre approche serait de réprimer lexpression des deux enzymes au moyen dARN-antisens et dévaluer lapoptose ainsi que la production des deux médiateurs lipidiques dans les péricytes transfectés soumis aux AGE-MGX. Linhibition complète de la production des DAG et des céramides na été associée quà une protection partielle des péricytes contre lapoptose. Ces résultats nous ont amenés à proposer lexistence dune seconde voie de signalisation, indépendante de ces deux médiateurs lipidiques.
Lactivité sphingomyélinase acide a été décrite initialement dans les lysosomes et les endosomes (Kanferet al.,mais également dans les cavéoles de la membrane 1966), plasmique (Liu et Anderson, 1995; Zundelet al., 2000; Grassméet al.,Le rôle des 2001). céramides dans un processus apoptotique, générés dans les compartiments acides par lA-SMase lysosomale, est aujourdhui controversé (Chatelutet al., 1998;Séguiet al.,2000). Il apparaît en fait que lA-SMase, responsable de la production de céramides pro-apoptotiques, serait localisée au niveau de la membrane plasmique, notamment dans les cavéoles (Zundelet al.,2000; Grassméet al.,2001). De façon intéressante, la formation de DAG par la PC-PLC, couplée à lactivation de lA-SMase, a également été montrée dans les cavéoles (Liu et Anderson, 1995). Mais la génération de céramides directement dans la mitochondrie est également capable dinduire lapoptose (Birbeset al.,Ainsi, il serait intéressant 2001). didentifier le compartiment subcellulaire de production des DAG et des céramides dans les péricytes apoptotiques, détablir sil existe des intermédiaires métaboliques entre les céramides et la mitochondrie (hypothèse dune production lysosomale ou cavéolaire) ou non
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(hypothèse dune production mitochondriale uniquement) et enfin didentifier les voies de signalisation activées par les céramides. Au moyen dinhibiteurs peptidiques spécifiques de caspases et dimmunoempreintes, nous avons montré lactivation de différentes caspases (initiatrices et effectrices) dans les péricytes rétiniens soumis aux AGE-MGX. Nous avons notamment identifié les caspases initiatrices engagées dans la transduction du message apoptotique. La caspase-8 ne semble pas être impliquée dans lapoptose des péricytes. Daprès les immunodétections, elle serait même probablement absente de ce type cellulaire. En revanche, dans les péricytes rétiniens bovins soumis aux AGE-MGX, la caspase-10 est présente et activée et semble contrôler la formation des DAG et des céramides. La caspase-10 bovine identifiée présenterait une séquence peptidique supplémentaire (kDa) par rapport aux isoformes longues des 4 caspases humaines 10/b (Vincenzet al., 1997) et 10/d (Hget al.,Cette variation de 1999). quelques kilodaltons pourrait être liée à limprécision faite sur la mesure. Une différence de masse moléculaire entre la forme humaine et bovine est néanmoins plausible et a dailleurs été observée pour une autre protéine, comme le récepteur aux AGE, RAGE (Neeperet al.,1992). Mais la production des céramides et des DAG pourrait également dépendre de lactivation de la caspase-2L. En se basant sur le modèle dactivation de la caspase-8 proposé dans différentes lignées cellulaires de lymphocytes (Droinet al.,nous pourrions 2001), imaginer que la caspase-2L interviendrait dans le processus dactivation de la caspase-10. Cette hypothèse pourrait être confirmée en examinant par immunoempreinte si le peptide z-VDVAD-fmk (inhibiteur de la caspase-2) inhibe le clivage protéolytique de la caspase-10. Une autre approche serait dobserver les effets des AGE sur lapoptose, le clivage de la caspase-10 et la production des DAG et des céramides dans les péricytes nexprimant plus la caspase-2L par une technique de transfection des cellules avec un ARN anti-sens. Une des limitations de notre étude est que les immunodétections des ces 3 caspases bovines ont été réalisées au moyen d'anticorps dirigés contre des antigènes humains. La réalisation dexpériences supplémentaires, comme des dosages d'activités enzymatiques après ELISA de capture avec des anticorps spécifiques et/ou des expériences d'amplification de gènes (RT-PCR), nous permettraient ainsi de confirmer l'expression de ces caspases et leur activation dans les péricytes soumis aux AGE-MGX. Le clonage de l'ADNc de la caspase-10 bovine, à partir d'une librairie d'ADNc de tissu bovin, comme cela a été effectué pour le clonage de RAGE (Neeperet al., 1992), permettrait d'accéder à la séquence peptidique et de confirmer éventuellement la différence de masse moléculaire suggérée entre la caspase-10 bovine et humaine.
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Nous avons également examiné limplication dun stress oxydant dans la transduction du message menant à lapoptose des péricytes. Lutilisation de différents antioxydants a montré une protection totale des péricytes contre lapoptose induite par les AGE associée à une inhibition complète de la formation des DAG et des céramides, suggérant un rôle critique du stress oxydant dans l'apoptose des péricytes rétiniens. Ce stress oxydant nest pas dû à des réactions de type Fenton liées aux ions métalliques qui sont chélatés par les AGE-MGX, comme le montrent nos expériences où les AGE-MGX traités par des chélateurs de métaux (EDTA et résine chelex-100) ont les même effets que les AGE-MGX natifs. Ceci suggère que les effets des AGE-MGX observés dans cette étude sont dûs à la structure peptidique des AGE et pas aux ions métalliques éventuellement liés. Ces expériences renforcent aussi la notion que les AGE-MGX induisent un stress oxydant non pas par un phénomène artéfactuel mais bien après liaison à un récepteur membranaire. Nos résultats viennent également conforter dautres étudesin vivo montrant le rôle du stress oxydant dans la disparition des péricytes par apoptose, que ce soit chez lHomme dans des péricytes rétiniens apoptotiques prélevéspostmortemsur des patients diabétiques (Li W. et al.,1999) ou chez le rat lors de ladministration dantioxydants, comme le trolox (Ansariet al.,1998) ou un mélange dantioxydants (Yatohet al.,2000; Kowluruet al.,2001) à des rats diabétiques. La production accrue de ROS, générant un stress oxydant, peut résulter d'un dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale (Zamzamiet al.,ou 1995)
d'activités enzymatiques, telles que des NADPH oxydases (Khwaja et Tatton, 1999), des lipoxygénases (O'Donnellet al.,1995), des NO synthases (Binderet al.,1999). Par ailleurs, la liaison des AGE à leur récepteur RAGE induit la formation intracellulaire de ROS (Yanet al.,1994) et l'activation de NADPH oxydase (Wautieret al.,Ainsi, les sources de 2001). production intracellulaire de ROS dans les péricytes soumis aux AGE-MGX pourraient être examinées en analysant les effets d'inhibiteurs de certaines de ces voies de formation de ROS sur l'apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX et la production des DAG et des céramides qui en résulte. Par exemple, l'implication d'une NADPH oxydase (Wautieret al.,2001) dans les péricytes pourrait être mise en évidence au moyen d'iodure de diphelylène alors que la production de ROS mitochondriaux pourrait être examinée au moyen d'inhibiteurs de la chaîne respiratoire, comme la roténone ou la TTFA (thenoyltrifluoroacétone).
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La deuxième voie de signalisation apoptotique activée par les AGE-MGX dans les péricytes, indépendante des deux médiateurs lipidiques, semble converger vers la mitochondrie et induire, de concert avec les céramides générés, lactivation de la caspase-9 et des caspases effectrices. Néanmoins, nous navons pas pu déterminer si la caspase-10 (initiatrice) est située au carrefour des deux voies de signalisation. Le rôle de la caspase-10 pourrait être examiné en réprimant son expression par un ARN antisens ou en transfectant les péricytes avec une forme inactive de la caspase-10 et en analysant les effets des AGE sur lapoptose des péricytes rétiniens. Des études ont montré que lapoptose peut être induite indépendamment de la génération de céramides et associée à une atteinte mitochondriale. Les caspases initiatrices semblent contrôler certaines de ces voies de signalisation impliquant les protéines régulatrices de lapoptose de la famille des Bcl-2 ou des kinases comme les JNKs (c-JUN-terminal kinases). Cest ainsi que la caspase-8 peut induire la protéolyse de Bid, membre de la famille des Bcl-2, générant un fragment pro-apoptotique qui entraîne la libération mitochondriale de cytochrome c et lactivation séquentielle de caspases effectrices (Li H.et al.,1998). Dautre part, les caspases initiatrices, notamment les caspase-8 et 10, par leurs domaines DED (localisés dans le prodomaine), peuvent également induire, indépendamment de leur fonction catalytique, lactivation de la voie des JNKs(Chaudharyet al., 1999), décrite dans les processus apoptotiques. Ces mécanismes pourraient jouer un rôle dans la voie de signalisation de lapoptose activée par les AGE-MGX dans les péricytes. Dautre part, laction des AGE sur leur récepteur, notamment RAGE, celui dont la cascade de signalisation est la mieux connue, met en jeu linduction dun stress oxydant et ras l'activation d'une cascade de kinases (p21 /PI3K/Akt/MAP kinases) qui active finalement le facteur de transcription NF-B (Yanet al.,1994; Landeret al.,1997; Deoraet al.,1998). Ce
facteur de transcription est impliqué dans diverses réponses cellulaires, dont l'apoptose. Par
exemple, la surexpression de RelA (sous-unité de NF-B) induit l'arrêt du cycle cellulaire et
l'apoptose dans des cellules B (Sheehy et Schlissel, 1999). NF-B peut également réguler lexpresion de protéines pro-apoptotiques, comme p53 (suppresseur de tumeur) (Nakaiet al.,2000), protéine contrôlant elle-même l'expression de Bax (Miyashita et Reed, 1995). Dailleurs, une étude toute récente vient de montrer que les AGE peuvent induire lapoptose des cellules mésangiales en activant p53 qui induit la surexpression de Bax, et que cette apoptose est inhibée par un traitement des cellules avec un antioxydant, la N-acétyl-L-cystéine (Yamagishial., et  2002b). Ces différents travaux permettraient de proposer lhypothèse que les AGE, en se liant à RAGE, peuvent induire un stress oxydant
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intracellulaire qui active NF-kB, celui-ci contrôlerait lactivation de p53 et la surexpression de Bax, protéine altérant la fonction mitochondriale. Dans les péricytes rétiniens, la participation éventuelle de ces différents acteurs moléculaires activés par la liaison des AGE à leur récepteur, indépendants des céramides, reste à définir. Les AGE sont décrits pour interagir avec des récepteurs spécifiques et induire des réponses cellulaires. Nos expériences avec les chélateurs de métaux suggèrent que les effets
observés dans notre étude sont bien dus à la protéine glyquée AGE et non aux ions métalliques liés dessus. Les effets des AGE-MGX sur l'apoptose des péricytes rétiniens sont certainement médiés par un de ces récepteurs, capables dinduire un signal intracellulaire: RAGE, ou AGE-R (p60, p90 et la galectine-3). En effet, le clivage protéolytique et lactivation de la caspase-10 initiatrice (et de la caspase-2?) dans les péricytes rétiniens suggère lactivation dun récepteur transmembranaire, comme un récepteur aux AGE, dans l'induction du signal de mort par les AGE-MGX. Nous avons montré, dans nos péricytes rétiniens, la présence dun récepteur spécifique aux AGE, RAGE, dont lexpression est stimulée en présence des AGE-MGX (voir résultats, chapitre I). Par ailleurs, RAGE, dont le domaine cytoplasmique est décrit comme essentiel dans la signalisation intracellulaire (Huttunenet al.,est capable de lier les AGE-MGX (Westwood 1999), et al., 1994) et d'induire un stress oxydant intracellulaire (Yanet al.,1994; Wautieret al.,2001), ce qui est conforme aux résultats décrits au cours de ce travail (cf. chapitre 4). Ces différentes données permettent de proposer RAGE comme un candidat potentiel dans l'activation de la caspase-10 (et de la caspase-2?) et la transduction du signal apoptotique dans les péricytes soumis aux AGE-MGX. Dailleurs, Yamagishiet al.ont montré récemment que la (2002a) surexpression de RAGE augmente la réponse apoptotique des péricytes rétiniens soumis à différents AGE. Les mécanismes moléculaires d'activation des caspases initiatrices impliquent la formation d'un complexe protéique transmembranaire, qui consiste en l'oligomérisation des récepteurs de morts. Bien qu'un tel phénomène n'ait pas été décrit pour RAGE, ce récepteur aux AGE est associé à une protéine homologue de la lactoferrine (Schmidtet al.,1992). En plus de RAGE qui est un dimère, le récepteur AGE-R formé par p60, p90 et galectine-3, localisé dans les cavéoles et qui est présent sur les péricytes (Stittet al.,1997; Chibberet al.,1997), forme un complexe trimérique lors de la liaison aux AGE (Stittet al.,2000b). RAGE et/ou dautres récepteurs présents sur les péricytes, activés par la liaison dun AGE, pourraient ainsi se comporter comme des récepteurs de mort et former un complexe transmembranaire, activant les caspases initiatrices. Cependant, lactivation des caspases
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initiatrices nécessite leur recrutement aux récepteurs de mort par des molécules adaptatrices (TRADD, RAIDD ou FADD) au niveau dun domaine de mort (DD) de la partie cytoplasmique des récepteurs (Kischkelet al.,1995 et 2001). Une comparaison de séquence de ce DD avec le domaine cytosolique de RAGE par le logiciel BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) indique que ce dernier ne contient pas dhomologie de séquence avec DD. En revanche, le fragment C terminal cytoplasmique de RAGE est riche en résidus glutamates chargés négativement qui pourraient être impliqués dans une reconnaissance protéine-protéine (Neeperet al., 1992). A ce jour, aucune étude na été réalisée en vue didentifier lacteur moléculaire directement couplé à la partie cytoplasmique de RAGE. Quant au complexe AGE-R, la protéine intracellulaire directement activée lors de la liaison dAGE à AGE-R apparaît être p90, interagissant avec la partie cytoplasmique de p60 (Stittet al.,1999). La signalisation intracellulaire induite semble intégrer une cascade de phosphorylations par des kinases (Caiet al.,De plus, nous ne pouvons pas exclure 2000). lhypothèse dun recrutement dune autre protéine que p90 au niveau du domaine
cytoplasmique de p60. Ceci a été décrit, par exemple, pour le récepteur du TNFpeut qui recruter, au niveau de deux domaines distincts, les protéines FAN (Adam-Klageset al.,1996) et TRADD (Wiegmannet al.,induisant deux voies de signalisations 1999) intracellulaires différentes. Nous pourrions rechercherin vitro si un récepteur aux AGE est impliqué dans la réponse apoptotique en surexprimant un récepteur aux AGE, comme RAGE (Yamagishiet al.,2002a) ou bien en analysant les effets dinhibiteurs de la liaison AGE/récepteur, comme lanticorps anti-RAGE (Yanet al., 1994), l'anticorps anti-p60 (Chibberet al., 1997) ou le
RAGE soluble (Wautieret al.,1996), sur lapoptose et la formation de DAG et de céramides et/ou lactivation de caspases dans les péricytes rétiniens. Une approchein vivocette de question pourrait également être envisagée par surexpression transgénique de récepteurs aux AGE, comme cela a été fait pour RAGE. Ainsi, l'apoptose de péricytes rétiniens pourrait être évaluée dans les souris transgéniques surexprimant RAGE (Yamamotoet al.,en 2001) comparaison aux animaux contrôles. Dans léventualité de lidentification dun récepteur aux AGE impliqué dans linduction de lapoptose des péricytes, le mécanisme de couplage de ce récepteur à lactivation de la caspase-10 initiatrice mérite dêtre investi. En conclusion, ces travaux proposent un nouveau mécanisme moléculaire responsable de la disparition par apoptose des péricytes rétiniens en réponse aux AGE accumulés au cours
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du diabète. La perte par apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX a été associée à l'activation de la caspase-10 initiatrice. Celle-ci contrôlerait la formation des médiateurs lipidiques impliqués dans lapoptose: les DAG et les céramides. Les deux voies métaboliques, dépendantes ou non des céramides, semblent converger vers la mitochondrie et induire l'activation de la caspase-9 ainsi que des caspases effectrices pour orienter la cellule dans la phase terminale de lapoptose. La disparition des péricytes au cours de la phase précoce de la rétinopathie est considérée comme une des altérations initiales précédant lapparition de lésions vasculaires caractéristiques de la rétinopathie, comme la formation de capillaires acellulaires (Mizutaniet al., 1996). La perte des péricytes rétiniens pourrait ainsi contribuer au développement de la maladie. Leur disparition, associée à celle des cellules endothéliales par apoptose dans certains capillaires, semblent mener à la formation de capillaires acellulaires (Engermanet al.,Mizutani 1989; et al.,phénomène pouvant contribuer à lhyperperméabilité 1996), vasculaire. Avec les cellules de Müller et les cellules endothéliales, les péricytes constituent la barrière hémato-rétinienne. Leur disparition pourrait conduire à un dysfonctionnement des cellules voisines, comme les cellules endothéliales. Les péricytes contrôlent en effet leur prolifération (Orlidge et Damore, 1987) et leur métabolisme cellulaire (Yamagishi et al., 1993). Par ailleurs, il a été montré récemmentin vitroque lapoptose des péricytes induite par des AGE est associée à une production accrue du facteur perméabilisant VEGF (Yamagishiet al.,2000a). VEGF est en effet augmenté dans la rétine de patients diabétiques au cours de la phase précoce de la maladie (Mathewset al., 1997). Ce facteur pourrait intervenir dans la perte de la perméabilité de la barrière hémato-rétinienne, observée dans la phase pré-clinique de la rétinopathie diabétique, en stimulant les processus de transcytose des constituants plasmatiques à travers lendothélium (Fenget al.,1999). La perte précoce des péricytes dans
les microvaisseaux rétiniens pourrait ainsi contribuer au développement de la rétinopathie, en participant notamment à la déstructuration de la barrière hémato-rétinienne et lhyperperméabilité vasculaire. La prévention ou le ralentissement de la disparition des péricytes par une approche pharmacologique contre une des cibles enzymatiques identifiées au cours de ce travail, constitue donc une nouvelle perspective de traitement de la rétinopathie diabétique.
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