VACCIN INACTIVE BIVALENT SALMONELLA ENTERITIDIS ET SALMONELLA TYPHIMURIUM. EVALUATION DE LA DUREE D

Florence

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VACCIN INACTIVE BIVALENT SALMONELLA ENTERITIDIS ET SALMONELLA TYPHIMURIUM. EVALUATION DE LA DUREE D’IMMUNITE PAR EPREUVES VIRULENTES. ETUDE DE LA CONTAMINATION OVARIENNE ET DE L’EXCRETION FECALE EN COURS DE PONTE 1 12 2 Galleau Stéphanie, Bizzini Sandrine, Yvorel Joëlle, Bobey Marianne, Jay Marie- 1 21 Laure ,Le Gros Francois-Xavier, Goutebroze Sylvain 1 MERIAL SAS – Centre de Recherche de Saint-Vulbas, Parc Industriel de la Plaine de l’Ain, Allée des Cyprès 01150 Saint-Vulbas 2 MERIAL SAS – Laboratoire de Lyon Gerland, 254 rue Marcel Mérieux, 69007 LYON RÉSUMÉ L’essai avait pour but d’étudier la persistance de l’immunité post-vaccinale contreSalmonellaEnteritidis (SE) et Salmonella Typhimurium(ST) en cours de ponte, après 2 injections de vaccin inactivé huileux bivalent à des poulettes de type ponte. L’étude comprenait un groupe d’animaux non vaccinés. Après des épreuves SE et ST indépendantes pratiquées par voie orale, la protection a été évaluée par numération bactérienne dans les fécès, 4 et 11 jours après épreuve pour ces deux germes, ainsi que par isolement dans l’ovaire 4 jours après épreuve pour SE. Ces tests ont été réalisés au pic de ponte (entre 27 et 31 semaines d’âge) et en fin de ponte (entre 52 et 61 semaines d’âge). En comparaison des animaux non vaccinés, l’immunité est apparue stable et s’est traduite par : - Unediminution statistiquement significative de l’excrétion fécale 4 et 11 jours après épreuve, la moyenne  géométriquedes titres en bactéries dans les fientes étant diminuée de 18 à 7673 fois pour ST, de 10 à 112  foispour SE. - Unediminution statistiquement significative du pourcentage d’ovaires infectés 4 jours après épreuve, ce  pourcentageétant réduit de 5 à 11 fois. Les études réalisées avec le vaccin inactivé bivalent Merial ont montré que son utilisation chez des poulettes futures pondeuses permet de diminuer de manière significative la contamination ovarienne parSalmonella Enteritidis et l’excrétion fécale deSalmonella EnteritidisetSalmonellaTyphimurium lors de l’exposition des poules à ces bactéries en début et en fin de ponte. ABSTRACT The aim of the experiment was to study the duration of immunity againstSalmonella(SE) and Enteritidis Salmonella Typhimurium(ST) during lay after two injections of a bivalent oil-adjuvanted inactivated bacterin vaccine in pullets. Unvaccinated control birds were included in the trial. After independent SE and ST challenges performed by the oral route, the protection was assessed by enumeration of bacteria in the faeces four and eleven days after challenge for the two bacteria and by isolation in the ovary 4 days after challenge for SE. These tests were performed at the peak of lay (between 27 and 31 weeks of age) and at the end of the laying period (between 52 and 61 weeks of age). In comparison to the unvaccinated birds, the immunity was stable and demonstrated as follows: - Astatistically significant reduction of SE and ST fecal excretion 4 and 11 days after challenge, the reduction  ofthe geometrical mean of the titres being between 18 and 7673 times for ST, between 10 and 112 times for  SE. - A statistically significant reduction of the percentage of infected ovaries 4 days after challenge, this  percentagebeing reduced between 5 and 11 times. The studies carried out with the bivalent oil-adjuvanted inactivated vaccine provided by Merial showed that its use in pullets significantly reduces the contamination of the ovary bySalmonellaEnteritidis and the fecal excretion ofSalmonellaand EnteritidisSalmonellaTyphimurium when the hens are exposed to these bacteria during the laying period.

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INTRODUCTION Depuis 2006, l’Union Européenne est engagée dans un programme d’éradication des salmonelloses chez les poules pondeuses dont l’objectif est d’atteindre une prévalence de 2% d’infection au maximum par Salmonella EnteritidisouSalmonella Typhimurium dans les cheptels de poules pondeuses (Règlement (CE) n° 1168/2006). Ce programme fait suite à l’étude de prévalence des salmonelles dans les parquets de poules pondeuses des 25 Etats membres conduite entre 2004 et 2005. Cette étude a fait état d’une prévalence moyenne pondérée de 20,3% pour SalmonellaEnteritidis et/ouSalmonellaTyphimurium en Europe et de 8% en France.SalmonellaEnteritidis etSalmonellaTyphimurium correspondent ainsi respectivement au premier et troisième sérovars les plus isolés (Collectif EFSA, 2006). En outre, ces deux sérovars sont les plus fréquemment impliqués dans les salmonelloses humaines. Les œufs étant considérés comme la principale source de salmonellose humaine en Europe, il apparaît donc judicieux de diminuer la prévalence des salmonelles et en particulier de SalmonellaEnteritidis etSalmonella Typhimurium dans les cheptels de poules pondeuses. Alors que les antimicrobiens ne doivent pas constituer une méthode spécifique de lutte contre les salmonelles chez les volailles, des programmes de vaccination contre SalmonellaEnteritidis vont être rendus obligatoires à partir de début 2008 dans les Etats membres dont la prévalence resterait supérieure à 10% (Règlement (CE) n° 1177/2006) avec comme objectif de réduire l’excrétion des bactéries et la contamination des œufs. Le laboratoire Merial a développé un vaccin inactivé bivalent contenantSalmonella(SE) et Enteritidis Salmonella(ST) répondant à cet Typhimurium objectif. L’effet de la vaccination a été évalué sur la contamination ovarienne expérimentale par Salmonella Enteritidiset sur l’excrétion fécale de SalmonellaEnteritidis etSalmonellaTyphimurium au cours de la période de ponte. Les résultats de ces études sont rapportés dans cet article. 1. MATERIELET METHODE 1.1.Elevage, vaccination et suivi sérologique Des poulettes conventionnelles ISABROWN vaccinées de manière standard au couvoir (bronchite infectieuse et maladie de Marek) ont été installées à l’âge d’un jour en cages d’élevage dans un bâtiment protégé. Une partie des poulettes (groupe GV) a été vaccinée avec un vaccin inactivé Merial contenant des souches SE PT4 (phage type 4) et ST lysotype DT104, cultivées en procédé haute densité, et adjuvées en émulsion huileuse. Une première injection a été pratiquée à l’âge de 6 semaines

(protocole vaccinal 1) ou 10 semaines (protocole vaccinal 2) et un rappel réalisé à 16 semaines d’âge. A chaque séance de vaccination, chaque poulette a reçu 0,3 mL de vaccin par voie intramusculaire au niveau du bréchet. Des poulettes témoins non vaccinées (groupe GT) ont été incluses dans l’étude. Toutes les poulettes des groupes GV et GT étaient élevées et vaccinées selon les conditions standard d’élevage des poulettes puis des pondeuses. Elles étaient ainsi hébergées en cages d’élevage puis en cages de ponte et faisaient l’objet d’un suivi zootechnique approprié. Elles ont reçu un programme de vaccination standard combinant des vaccins vivants administrés entre 4 et 14 semaines d’âge et un  vaccin multivalent inactivé (Gallimune407, valences maladie de Newcastle, bronchite infectieuse, pneumovirose aviaire et syndrome chute de ponte) injecté à 16 semaines d’âge. Les anticorps spécifiques deSalmonellaEnteritidis et SalmonellaTyphimurium ont été quantifiés respectivement par une technique ELISA (kit ® Flockcheck Se,IDDEX) et une technique de séroagglutination lente sur des prélèvements sanguins réalisés régulièrement. 1.2.Epreuves virulentes Calendrier Au cours de la période de ponte, des poules des groupes GV et GT ont été transférées en bâtiment confiné pour réalisation des épreuves virulentes salmonelles. Des épreuvesSalmonella Enteritidisont été pratiquées à 27 et 58 semaines d’âge pour évaluer l’effet du vaccin sur la contamination ovarienne. Afin d’évaluer l’effet du vaccin sur l’excrétion fécale, des épreuvesSalmonellaEnteritidis ont été réalisées à 31 et 52 semaines d’âge et des épreuvesSalmonella Typhimurium à 31 et 61 semaines d’âge. Les épreuvesSalmonella Enteritidisconduites à 27 et 31 semaines d’âge ont utilisé des poules vaccinées selon le protocole vaccinal 2, toutes les autres épreuves ont utilisé des poules vaccinées selon le protocole vaccinal 1. Suspensions d’épreuve Pour le critère “contamination ovarienne”, les épreuvesSalmonellaont été réalisées en Enteritidis utilisant une souche SE PT4 hétérologue à la souche vaccinale. Pour le critère “excrétion fécale” de Salmonellaune souche dérivée de la Enteritidis, première et présentant une résistance induite à l’acide nalidixique a été utilisée. Les épreuvesSalmonella Typhimurium ont été réalisées avec une souche lysotype DT104 hétérologue à la souche vaccinale et présentant notamment une résistance naturelle à l’ampicilline. Avant chaque épreuve, une culture fraîche de la souche appropriée a été préparée en bouillon LB (Luria Bertani) dont la densité bactérienne était de 7 ou 8 log10 Unités Formant Colonies par mL (UFC/mL) pour l’évaluation de la contamination

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ovarienne par SE et de 9 log10 UFC/mL pour l’évaluation de l’excrétion fécale de SE et ST. Inoculation et prélèvements Après une diète alimentaire et hydrique d’environ 4 heures, chaque poule vaccinée et témoin a été inoculée par voie orale avec 1 mL de la suspension d’épreuve appropriée. L’inoculation a été réalisée par gavage au moyen d’une seringue munie d’un cathéter souple, directement dans l’œsophage. Pour l’évaluation de la contamination ovarienne par SE, les poules ont été euthanasiées de façon éthique 4 jours après épreuve. Sur chaque poule, l’ovaire a été prélevé en conditions stériles puis conditionné individuellement. Pour l’évaluation de l’excrétion fécale de SE et ST, 4 et 11 jours après épreuve, des échantillons individuels de fientes caecales fraîches ont été prélevés sur chaque poule vaccinée et témoin puis pesés. Immédiatement après prélèvement, les échantillons ont été transmis au laboratoire sous couvert du froid pour recherche de la souche d’épreuve. Traitement des prélèvements Chaque prélèvement d’ovaire a été repris dans un volume fixe d’eau physiologique tamponnée (EPT) puis broyé. Cent µL de la suspension obtenue ont été étalés sur milieu gélosé sélectif Xylose Lysine Tergitol 4 (XLT4) pour un isolement direct des salmonelles. Vingt-quatre et 48 heures après incubation à 37°C, la présence ou l’absence de colonies caractéristiques de Salmonelles a été notée. En parallèle, le reste de la suspension initiale a été incubé environ 24 heures à 37°C. 100 µL du bouillon de pré-enrichissement ainsi obtenu ont été alors repris dans 10 mL de milieu Rappaport Vassiliadis (RV) et incubés environ 24 heures à 42°C (phase d’enrichissement). Quand l'étalement direct était négatif, un ré-isolement des Salmonelles dans le bouillon d’enrichissement a été réalisé par étalement sur gélose XLT4. La présence ou l’absence de colonies caractéristiques de Salmonelles a alors été notée après 24 heures d’incubation à 37°C. Chaque prélèvement de fientes a été repris dans un volume fixe d’EPT puis le mélange a été homogénéisé. Quatre dilutions de raison 10 du liquide de broyage ont ensuite été réalisées en EPT. 100µl de chacune des 5 suspensions ainsi obtenues ont été étalés sur gélose XLT4 supplémentée en acide nalidixique pour les épreuves SE ou en ampicilline pour les épreuves ST. Vingt-quatre et 48 heures après incubation à 37°C, un comptage des colonies caractéristiques des salmonelles a été réalisé sur chaque boîte. En parallèle de cette procédure d’isolement direct, le liquide de broyage initial a fait l’objet d’un pré-enrichissement et d’un enrichissement selon la même méthodologie que celle décrite pour les prélèvements d’ovaire. Pour chaque animal, l'identité d’une des colonies caractéristiques a été confirmée par séroagglutination (sérum polyvalent anti-salmonelle OMA).

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1.3.Analyse des résultats Selon les résultats de la recherche de salmonelles, chaque échantillon d’ovaire a été classé dans l’une des catégories suivantes : négatif, positif après les phases de pré-enrichissement et d’enrichissement ou positif à l’isolement direct. Un tableau de contingence a été établi en considérant le nombre d’échantillons appartenant à chaque catégorie pour le groupe vacciné et le groupe témoin. Les groupes ont alors été comparés par un test exact de Fisher. Pour les échantillons de fientes, lorsque l’isolement direct était positif, le titre en salmonelles exprimé en UFC/g a été calculé. Pour les échantillons négatifs en isolement direct mais positif après les phases de pré- enrichissement et d’enrichissement, le titre a été considéré égal à 10 UFC/g. Pour les échantillons négatifs, le titre a été considéré égal à 0 UFC/g. Préalablement à l’analyse statistique, une transformation logarithmique des titres a été effectuée (log10 (CFU/g+ 1)).A chaque date de prélèvement, les résultats obtenus chez les vaccinés et chez les témoins ont été comparés par un test unilatéral de comparaison des moyennes (testtStudent) si les de conditions d’application du test étaient vérifiées (normalité des distributions et homogénéité des variances intra-groupes). Sinon, les 2 groupes ont été comparés par un test de comparaison des médianes (test de Wilcoxon). Lorsque la différence entre les deux groupes n’était pas significative à chaque date, les résultats obtenus aux deux dates ont été cumulés, puis les groupes vacciné et témoin ont été comparés comme décrit précédemment. Pour tous les tests statistiques utilisés, le seuil de significativité a été fixé àα= 5%. 2. RESULTATS 2.1Sérologies Le résultat du suivi sérologique des animaux vaccinés et témoins est présenté dans la Figure 1. Le suivi sérologique a validé que les poules témoins non vaccinées sont restées négatives vis à vis de Salmonellaet EnteritidisSalmonella Typhimurium jusqu’à la fin de la période de suivi. Dès la primo- vaccination, une séroconversion a été obtenue vis à vis deSalmonella EnteritidisetSalmonella Typhimurium chez les poules vaccinées. Un effet rappel a été observé suite à l’injection pratiquée à 16 semaines. Suite au rappel, les titres en anticorps sont restés élevés jusqu’à 52 semaines d’âge pour Salmonellails ont diminué jusqu’à 36 Enteritidis, semaines d’âge pour rester stables à un niveau nettement supérieur aux témoins pourSalmonella Typhimurium.

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2.2 Isolement de SE et ST dans l’ovaire et les significative la contamination ovarienne par fientes Salmonella Enteritidis et l’excrétion fécale de  SalmonellaEnteritidis et Salmonella Typhimurium L’ensemble des résultats obtenus est présenté dans leslors d’exposition des poules à ces bactéries en début Figures 2 à 4.et en fin de ponte. Cet effet significatif de la Le nombre d’ovaires où SE a été retrouvé 4 joursvaccination sur la contamination des organes et après des épreuves pratiquées à 27 et 58 semainesl’excrétion fécale sans conférer une protection totale d’âge était inférieur de manière significative chez lesde l’animal est conforme aux résultats obtenus avec poules vaccinées par rapport aux poules témoins. Ded’autres vaccins vivants ou inactivés (Barrow P.A., plus, lorsque SE a été isolée chez les poules2000 ; Cooper et al., 1992 ; Gast et al., 1992 ; Hassan vaccinées, elle l’a été uniquement aprèset al., 1990). Compte tenu des démonstrations faites, enrichissement alors que chez les témoins, SE al’utilisation du vaccin inactivé bivalent Merial trouve parfois été retrouvée à l’isolement direct.pleinement sa place aux côtés des mesures habituelles Les titres en SE dans les fientes 4 et 11 jours aprèsde prophylaxie sanitaire pour lutter contre le risque de une épreuve pratiquée à 31 semaines d’âge étaientsalmonellose humaine liée à la consommation d’œufs. réduits de manière significative chez les poules vaccinées par rapport aux poules témoins. A 52 semaines, la réduction était significative uniquement CONCLUSION 11 jours après épreuve et lorsque les résultats obtenus 4 et 11 jours après épreuve ont été cumulés. Les titres en ST dans les fientes, 4 et 11 jours aprèsLes essais ont démontré la capacité du vaccin inactivé des épreuves pratiquées à 31 et 61 semaines d’âge,bivalent Merial à diminuer de manière significative la étaient réduits de manière significative chez les poulescontamination ovarienne parSalmonellaEnteritidis et vaccinées par rapport aux poules témoins.l’excrétion fécale deSalmonellaEnteritidis et L’efficacité du vaccin inactivé bivalent Merial a étéSalmonellaTyphimurium suite à des infections démontrée en début et fin de ponte pour les critèresexpérimentales réalisées en début et en fin de ponte. contamination ovarienne par SE et excrétion fécale de SE et ST. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 3. DISCUSSION  BarrowP.A., 2000. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.,  19(2),351-375. La contamination de l’œuf par Salmonella EnteritidisCollectif EFSA, 2006. The EFSA Journal, 81, 1-71. et Salmonella Typhimurium a pour origine laCooper G.L. et al., 1992. Vaccine, 10(4), 247-254. transmission verticale depuis l’ovaire de SalmonellaGast R.K. et al., 1993. Av. Dis., 37(4), 1085-1091. Enteritidis qui entraîne une contamination du jaune deHassan J.O. et al., 1990. Res Microbiol., 141, 839- l’œuf et l’excrétion fécale de Salmonella Enteritidis et850. Salmonella Typhimurium qui entraîne uneRèglement (CE) n° 1168/2006, Journal Officiel de contamination de la coquille de l’œuf.Les étudesl’UE, L 211/4, 2006. réalisées avec le vaccin inactivé bivalent Merial ontRèglement (CE) n° 1177/2006, Journal Officiel de montré que son utilisation chez des poulettes futuresl’UE, L 212/3, 2006. pondeuses permet de diminuer de manière Figure 1.Résultat du suivi sérologiqueSalmonellaEnteritidis etSalmonellaTyphimurium des poules vaccinées avec le vaccin inactivé bivalent Merial à 6 et 16 semaines (protocole vaccinal 1) ou 10 et 16 semaines (protocole vaccinal 2) et des poules témoins non vaccinées correspondantes.

Salmonella Typhimurium (séroagglutination lente) Salmonella Enteritidis (ELISA) 300 100 90 GV - protocole vaccinal 1 250 80 GT 70 200 60 GV - protocole vaccinal 1 50 150 GT du protocole vaccinal 1 40 GV - protocole vaccinal 2 30 GT du protocole vaccinal 2 100 20 10 50 0 - 10 0 0 4 812 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 0 4 812 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Age (semaines) Age (semaines)

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Figure 2. Résultatsde l’isolement deSalmonelladans l’ovaire des poules vaccinées (GV) et Enteritidis témoins (GT) 4jours après une épreuveSalmonellaEnteritidis réalisée à 27 ou à 58 semaines d’âge. A chaque épreuve, n=15 pour GV et GT. Le résultat des comparaisons statistiques de GV et GT ainsi que les tests utilisés sont indiqués (seuil de significativité fixé àα=5%).

Epreuve Salmonella Enteritidis à 27 semaines d'âge 15 Négatif Positif après enrichissement 12 Positif à l'isolement direct 9

6 3 0 GV GT Test exact de Fisher, p=0.000

Epreuve Salmonella Enteritidis à 58 semaines d'âge 15 Négatif Positif après enrichissement 12 Positif à l'isolement direct 9 6 3 0 GV GT Test exact de Fisher, p=0.015

Figure 3.Résultats de l’isolementSalmonellaEnteritidis dans les fientes des poules vaccinées et témoins 4 et 11 jours après une épreuveSalmonellaEnteritidis réalisée à 31 ou à 52 semaines d’âge. A toutes les dates, n=12 pour GV et GT excepté 4 jours après l’épreuve réalisée à 31 semaines où n=11 pour GV. Le résultat des comparaisons statistiques de GV et GT ainsi que les tests utilisés sont indiqués (tests unilatéraux, seuil de = Epreuve Salmonella Enteritidis à 31 semaines d'âgeEpreuve Salmonella Enteritidis à 52 semaines d'âge 8 8

6

4

2

0 GV GT GV GT 4 oursost-é reuve11 oursost-é reuve Test t de Student,Test de Wilcoxon, p=0.009 p=0.005

6

4

2

0 GV GT GV GT 4 oursost-é reuve11 oursost-é reuve Test de Wilcoxon, p=0.032

Figure 4.de l’isolement de RésultatsSalmonella Typhimuriumdans les fientes des poules vaccinées et témoins 4 et 11 jours après une épreuveSalmonellaTyphimurium réalisée à 31 ou à 61 semaines d’âge. A toutes les dates, n=12 pour GV et GT excepté 11 jours après l’épreuve réalisée à 61 semaines où n=11 pour GT. Le résultat des comparaisons statistiques de GV et GT ainsi que les tests utilisés sont indiqués (tests = Epreuve Salmonella Typhimurium à 31 semaines d'âgeEpreuve Salmonella Typhimurium à 61 semaines d'âge 8 8

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6

4

2

0 GV GT GV GT 4 oursost-é reuve11 oursost-é reuve Test de Wilcoxon,Test de Wilcoxon, p=0.008 p=0.020

6

4

2

0 GV GT GV GT 4 oursost-é reuve11 oursost-é reuve Test de Wilcoxon,Test de Wilcoxon, p=0.001 p=0.001

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