Metalloproteins and protein-protein complexes investigated by CW and pulsed EPR spectroscopy [Elektronische Ressource] / von Sevdalina Lyubenova

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• Publié par: goethe_universitat_frankfurt_am_main
• Publié le: 01 janvier 2006
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• Langue: Deutsch
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Extrait

Metalloproteins and protein-protein complexes investigated by
CW and pulsed EPR spectroscopy




Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften



vorgelegt beim Fachbereich Chemische und Pharmazeutische Wissenschaften
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main




von
Sevdalina Lyubenova
aus Veliko Tarnovo, Bulgarien





Frankfurt am Main 2006
D30






vom Fachbereich Chemische und Pharmazeutische Wissenschaften
der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt als Dissertation angenommen.




Dekan: Prof. Dr. Harald Schwalbe

Gutachter: Prof. Dr. Thomas Prisner
Prof. Dr. Bernd Ludwig


Datum der Disputation: 27. 06. 2006











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Zusammenfassung

Eines der zentralen Forschungsziele in der biophysikalischen Chemie ist die Aufklärung
der Struktur und Funktion von Membranproteinen, die in Energieübertragungswegen eine
Rolle spielen. Sowohl die aerobe als auch die anaerobe Atmung beinhalten
Elektronentransfer und Protonentranslokation durch die mitochondrialen und bakteriellen
Membranen. Die Elektronentransferprozesse führen zu Änderungen im
Oxidationszustand der beteiligten Kofaktoren, wodurch paramagnetische Spezies
entstehen können. Aus diesem Grund ist die elektronenparamagnetische
Resonanzspektroskopie (EPR-Spektroskopie) die Methode der Wahl, um Informationen
über die elektronische und molekulare Struktur der paramagnetischen Intermediate zu
erhalten. Diese strukturellen Informationen sind wiederum direkt verknüpft mit
Erkenntnissen über die Funktion der Proteine der Atmungskette.
In dieser Arbeit wurden Multifrequenz-Continuous-Wave- (CW) und Puls-EPR-
Spektroskopie verwendet, um die Molybdänbindungsstelle in Polysulfidreduktase (Psr)
aus dem anaeroben Bakterium Wolinella succinogenes sowie den Protein-Protein-
Komplex zwischen Cytochrom c-Oxidase (CcO) und Cytochrom c aus dem aeroben
Bakterium Paracoccus denitrificans zu charakterisieren.


Molybdän in Psr
Psr ist ein essentielles Enzym für die Schwefelatmung von Wolinella succinogenes.
Biochemische Studien deuten darauf hin, dass das aktive Zentrum dieses Enzyms ein
mononukleares Molybdänzentrum enthält, das die Reduktion des Polysulfidsubstrats zu
Sulfid katalysiert. Da keine Kristallstruktur von Psr existiert, müssen biochemische und
spektroskopische Methoden angewandt werden, um strukturelle Informationen über
dieses Enzym zu gewinnen. In der vorliegenden Arbeit wurden daher CW- und moderne
Puls-EPR-Techniken verwendet, um das katalytisch aktive Zentrum zu untersuchen.
Im ersten Teil dieser Dissertation wurden verschiedene Reduktionsmittel eingesetzt, um
paramagnetische Zustände von Psr zu generieren. Anschließend wurde Multifrequenz-
EPR-Spektroskopie zur Identifikation der Mo(V)-Spezies verwendet. Mit Hilfe von Simulationen der experimentellen Spektren konnten – basierend auf Molybdän-
Hyperfeinkopplungs- und g-Tensorwerten – drei verschiedene Zustände identifiziert
werden. Auf Grund eines Vergleichs dieser EPR-Parameter mit denen verwandter und
gut charakterisierter Enzyme konnte gefolgert werden, dass je nach Zustand fünf oder
sechs Schwefelliganden an das Molybdänzentrum koordiniert sind. Derjenige Zustand,
der durch Zugabe von Polysulfid entsteht, wurde als katalytisch aktive Form
vorgeschlagen. In diesem aktiven Zustand sollte als sechster Ligand ein Schwefelatom
der Polysulfidkette an das Molybdän gebunden sein. Um die postulierte Nähe des
Polysulfids zum Molybdänzentrum über Hyperfeinwechselwirkungen nachzuweisen,
33wurde S-markiertes Polysulfid synthetisiert und als Substrat eingesetzt. Im Anschluss
33daran wurden 1D-ESEEM- und 2D-HYSCORE-Spektroskopie zur Detektion der S-
33Hyperfein- und S-Quadrupolwechselwirkungen verwendet, da diese Wechselwirkungen
zu klein waren, um in konventionellen CW-EPR-Spektren beobachtet werden zu können.
33Bis heute existiert nur eine einzige Puls-EPR-Studie, die S-Wechselwirkungen
33behandelt, da der S-Kern einen Kernspin I = 3/2, ein großes Kernquadrupolmoment und
33eine niedrige Larmorfrequenz aufweist. All diese Eigenschaften machen es schwer, S
33zu detektieren und aus den S-Spektren strukturelle Informationen zu gewinnen. In
33dieser Arbeit war es jedoch mittels Analyse der 2D-Daten möglich, den Mo(V)- S-
Abstand auf einen Bereich von 2 bis 2.5 Å einzugrenzen. Bekannte Mo-S-Abstände für
Molybdänenzyme der gleichen Familie liegen zwischen 1.8 und 2.8 Å, was den Schluss
33nahe legt, dass S aus Polysulfid tatsächlich der sechste Ligand des Mo(V)-Zentrums.
Damit konnte demonstriert werden, dass Polysulfid das Substrat von Psr ist. Die
präsentierte Untersuchung unterstreicht, dass HYSCORE-Experimente eine
wirkungsvolle Methode darstellen, um detaillierte Einblicke in die Strukturen von aktiven
Zentren von Molybdänenzymen und den Reaktionsweg von Substratatomen während der
Katalyse zu gewinnen. Dichtefunktionaltheorie-Rechnungen (DFT-Rechnungen) und
quantitative numerische Simulationen der 2D-Daten können in diesem Zusammenhang
helfen, weitere strukturelle Details über die Molybdänbindungsstelle in Psr aus den
experimentellen Daten zu extrahieren.

CcO:Cytochrom c-Komplex
Die Bildung von Protein-Protein-Komplexen ist ein wichtiger Schritt in biologischen
Prozessen der Energieumwandlung wie z.B. der Atmung oder der Photosynthese. Solche
relativ kurzlebigen Protein-Protein-Komplexe sind an langreichweitigen
Elektronentransferreaktionen beteiligt. In den Elektronentransportketten der bakteriellen
und mitochondrialen Atmung findet die Bildung eines Komplexes zwischen CcO und
Cytochrom c statt. Nach der Komplexbildung werden die Elektronen, die CcO zur
Reduktion von von O zu H O benötigt, von Cytochrom c auf CcO übertragen. In dieser 2 2
Arbeit wurde die Komplexbildung zwischen CcO und Cytochrom c aus Paracoccus
denitrificans mit Hilfe gepulster EPR-Spektroskopie untersucht. Hierbei sollte der
Einfluss der abstands- und orientierungsabhängigen Elektronenspin-Dipol-Dipol-
Wechselwirkung zwischen verschiedenen paramagnetischen Zentren auf die
Elektronenspin-Relaxation (‚relaxation enhancement’) ausgenutzt werden, um
verschiedene CcO-Cytochrom-Komplexe zu charakterisieren.
Daher wurden Zweipuls-Elektronenspinecho-Experimente auf Mischungen aus der
löslichen Untereinheit II von CcO, die das Cu -Zentrum enthält, bzw. der kompletten A
CcO mit Cytochrom c , dem physiologischen Partner, oder Cytochrom c aus 552
Pferdeherzen angewandt. In allen vier Fällen konnte eine deutlich verstärkte Relaxation
des Cu , die durch die Bildung spezifischer Protein-Protein-Komplexe verursacht wurde, A
beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigte sich in Experimenten mit dem
nichtbindenden Cytochrom c nur eine sehr geringe Verstärkung der Relaxation auf 1
Grund von unspezifischen Protein-Protein-Wechselwirkungen. Ein Vergleich der
Echozerfälle des langsam relaxierenden Beobachter-Spins (Cu in CcO) in An- bzw. A
Abwesenheit des schnell relaxierenden Elektronenspins (Fe(III) im Cytochrom) erlaubte
es, die rein dipolaren Relaxationsbeiträge für die verschiedenen Komplexe zu separieren
und getrennt zu untersuchen. Durch temperaturabhängige Messungen war es möglich,
den dipolaren Charakter der beobachteten Verstärkung der Relaxation zu beweisen.
Schließlich wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die verwendete experimentelle
Herangehensweise auch für den CcO-Cytochrom c-Komplex mit der kompletten CcO,
die insgesamt vier paramagnetische Zentren enthält, funktioniert. Quantitative Simulationen der erhaltenen Daten für die verschiedenen Komplexe ergaben
eine breite Abstands- (2-4 nm) und Orientierungsverteilung für die relative Anordnung
der Cu - und Fe(III)-Zentren. Um die Strukturen der Komplexe noch detaillierter zu A
analysieren und die bisherigen Ergebnisse zu untermauern, werden Hochfeld-EPR-
Experimente durchgeführt werden.
Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass der Einfluss
dipolarer Relaxation auf die Ergebnisse gepulste EPR-Experimente dazu verwendet
werden kann, Abstände zwischen und relative Orientierungen von paramagnetischen
Metallzentren zu untersuchen. Weiterhin wurde auf einem qualitativen Niveau
demonstriert, dass diese – zu anderen biophysikalischen Techniken komplementäre –
Methode geeignet ist, um kurzlebige Elektronentransfer-Protein-Protein-Komplexe zu
studieren. Schließlich konnte in dieser Arbeit experimentell belegt werden, dass die
beschriebene Methode auf biologische Systeme mit mehr als zwei paramagnetischen
Zentren angewandt werden kann. Dieses Resultat ist insbesondere von Interesse für
zukünftige Charakterisierungen von Membranprotein-Superkomplexen. Contents

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