Molecular and biochemical analyses of transgenic Nicotiana tabacum plants metabolizing glycolate in the chloroplasts [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Krishnaveni Thiruveedhi

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• Publié par: rheinisch-westfalischen_technischen_hochschule_-rwth-_aachen
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 39
• Langue: Deutsch
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Extrait

“Molecular and biochemical analyses of transgenic
Nicotiana tabacum plants metabolizing glycolate in the
chloroplasts”





Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der
Rheinisch Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der
Naturwissenschaften genehmigte Dissertation




vorgelegt von

Master of Science
Krishnaveni Thiruveedhi
aus Guntur, India



Berichter: Universitätsprofessor Dr. F. M. Kreuzaler
Privatdozent Dr. C. Peterhänsel





Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2006

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar














Institute for Biology I (Botany and Molecular Genetics)
RHEINISCH WESTFÄLISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE AACHEN



PhD Thesis


Molecular and biochemical analyses of transgenic
Nicotiana tabacum plants metabolizing glycolate in the
chloroplasts





Presented by

M.Sc. Krishnaveni Thiruveedhi
From Guntur, India





Scientific Supervision
Referent: University Professor Dr. F. Kreuzaler
Co-referent: Privatdozent Dr. C. Peterhänsel



Aachen, December 2006.



ZUSAMMENFASSUNG

Die Photorespiration von C-Pflanzen führt neben dem Verlust an ATP und 3
Reduktionsäquivalenten dazu, dass ~25% des zuvor in der Photosynthese fixierten
Kohlenstoffs wieder verloren gehen. In der hier vorliegenden Arbeit wird ein alternativer
Stoffwechselweg in den Chloroplasten von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum) etabliert.
Mittels dieses Stoffwechselweges soll eine Steigerung der Refixierung von CO innerhalb der 2
Chloroplasten erfolgen und somit die Photorespiration von C -Pflanzen reduziert werden. Der 3
hier beschriebene Stoffwechselweg basiert auf der Umsetzung von Glycolat, welches
während der Photorespiration gebildet wird, zu Glycerat. Für diese Umwandlung sind in E.
coli die Aktivitäten dreier Enzyme notwendig: Glycolatdehydrogenase (GDH),
Glyoxylatcarboligase (GCL) und Tartronatsemialdehydreductase (TSR). In der vorliegenden
Arbeit wurden jedoch nur die GCL und TSR aus E. coli verwendet, während die GDH aus
Arabidopsis thaliana stammt. Transgene Tabakpflanzen mit den notwendigen Genen wurden
hergestellt. Das Expressionsniveau der entsprechenden Gene wurde mittels RT-PCR
überprüft. Darüber hinaus wurde die Proteinaktivität mittels Aktivitätstests sichergestellt.

Um den Einfluss des integrierten Stoffwechselweges zu untersuchen, wurden verschiedene
physiologische, biochemische und photosynthetische Messungen durchgeführt. Diese
Messungen wurden sowohl unter ambienten, als auch unter photorespiratorischen
Bedingungen durchgeführt. Für transgene AtGDH Pflanzen konnte mittels der Messung des
„post illumination burst“ (PIB) eine Reduktion der Photorespiration gezeigt werden. Diese
Reduktion ist weiter gesteigert, wenn alle Transgene in einer Pflanze exprimiert werden.
Neben dem reduzierten PIB konnte eine Reduktion des CO -Kompensationspunktes ( Γ) und 2
eine Erhöhung der CO -Assimilation unter photorespiratorischen Bedingungen festgestellt 2
werden. Darüber hinaus zeigen die Blätter der transgenen Pflanzen einen erhöhten Anteil an
Glucose und Fructose, welche Endprodukte der Photosynthese sind. Anhand des Frisch- und
Trockengewichts der Blätter kann auf eine erhöhte Produktivität der Pflanzen geschlossen
werden. Viele dieser Effekte findet man auch in den Pflanzen, in denen nur die
Glycolatdehydrogenase in den Chloroplasten exprimiert wird. Anhand dieser Daten kann
geschlussfolgert werden, dass die Etablierung dieses Stoffwechselweges zu einer Reduktion
der Photorespiration und einer Verbesserung des Wachstums führt.


SUMMARY I
SUMMARY

The photorespiratory pathway in C plants consumes not only ATP and reducing equivalents 3
but also results in loss of ~ 25% carbon that has been fixed during the process of
photosynthesis. In the present study, an alternative biochemical pathway for the metabolism
of glycolate was established in the chloroplasts of tobacco (Nicotiana tabacum) plants. The
new pathway aims at increasing the refixation of CO inside the chloroplasts and thereby at 2
suppressing photorespiration in C plants. The pathway is derived from E. coli and converts 3
the glycolate formed during photorespiration into glycerate. Three enzymatic activities are
required: glycolate dehydrogenase (GDH), glyoxylate carboligase (GCL), and tartronic
semialdehyde reductase (TSR). Instead of E. coli GDH, the glycolate dehydrogenase from
Arabidopsis thaliana (AtGDH) was used. Transgenic N. tabacum plants containing the
necessary genes were generated. The expression level of the transgenes was analyzed by RT-
PCR and the respective enzymatic activity assays showed that the proteins are active in
planta.

Various physiological, biochemical and photosynthetic measurements were performed under
ambient and enhanced photorespiratory conditions to evaluate the impact of the established
pathway in planta. By measuring the postillumination burst (PIB), a clear reduction in
photorespiration was determined in plants transgenic for AtGDH. A further reduction of the
photorespiratory flow was observed when all the transgenes were expressed in one plant
(GTA). Additionally, the establishment of the bacterial glycolate pathway in plant
chloroplasts results in a decrease of the CO compensation point ( Г). The CO assimilation 2 2
rates in transgenic plants were enhanced under photorespiratory conditions. Moreover, leaves
of transgenic plants expressing the glycolate pathway showed higher glucose and fructose,
end products of photosynthesis. Leaf fresh and dry weight measurements revealed that total
plant productivity might be enhanced. Most of the above described effects were also observed
in plants that overexpressed glycolate dehydrogenase alone. It can be concluded that
expression of the bacterial glycolate pathway in C plant chloroplasts results in a reduction of 3
photorespiration and an enhancement of plant growth.







TABLE OF CONTENTS II
TABLE OF CONTENTS
1 INTRODUCTION..................................................................................................1
1.1 Photosynthesis ..........................................................................................................................................1
1.1.1 C Cycle ................................................................................................................................................2 3
1.1.2 C photosynthesis.................4 4
1.1.3 The Crassulacean Acid Metabolism (CAM) .........................................................................................5
1.1.4 Single cell C photosynthesis ................................................................................................................6 4
1.2 Photorespiration.......................................................................................................................................7
1.2.1 Photorespiratory pathway in C plants7 3
1.2.2 Glycolate metabolism in algae............9
1.2.3 Glycolate metabolism in Escherichia coli...........................................................................................12
1.2.4 etabolism in cyanobacteria ..............................................................................................13
1.3 The aim of the present study.................................................................................................................15
2 MATERIALS AND METHODS...........................................................................17
2.1 Materials.................................................................................................................................................17
2.1.1 Chemicals and Consumables...............................................................................................................17
2.1.2 Enzymes and Antibodies.....................................................................................................................17
2.1.3 Instruments..........................................................................................................................................19
2.1.4 Solutions, buffers and media............20
2.1.5 Matrix and Membranes ...........................................................................................................27
2.1.6 Escherichia coli strains........................................................................................................................27
2.1.7 Agrobacterium strain................27
2.1.8 Plant Materials ....................................................................................................................................28
2.1.9 Synthetic Oligonucleotides ..................