Molecular Biology Techniques Applied to Food Industry Water Surveillance [Elektronische Ressource] / Jessica Varela Villarreal. Betreuer: U. Obst

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: karlsruher_institut_fur_technologie
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 29
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

Molecular Biology Techniques Applied
to Food Industry Water Surveillance
zur Erlangung des akademischen Grades eines
DOKTORS DER INGENIEURWISSENSCHAFTEN (Dr. -Ing.)
der Fakult at fur Chemieingenieurwesen und Verfahrenstechnik
des Karlsruher Institut fur Technologie (KIT)
genehmigte
DISSERTATION
von
Dipl. Biochem. Jessica Varela Villarreal
aus Mexiko
Referent: Prof. Dr. rer. nat. Ursula Obst
Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Christoph Syldatk
Tag der mundlic hen Prufung: 10.06.2011Acknowledgments
I would like to express my deepest gratitude to my Ph.D. supervisor, Prof. Dr. Ursula
Obst, for her assistance and support as for giving me the possibility to carry out my Ph.D.
project at the Institute of Functional Interfaces (IFG) at KIT Campus Nord. I am also
grateful to Prof. Dr. Syldatk from the Chair of Technical Biology of the Department of
Chemical Engineering at KIT Campus Sud for taking over the co-reference of this work.
I want to specially thank Dr. Thomas Schwartz for his guidance and patience, for his
helpful advices and discussions, and for his constant motivation and engagement.
I thank all my colleagues at the institute for the friendly atmosphere. My special
thanks to Dr. Christina Jungfer for her constant support and motivation since the very
beginning. I also thank Dr. Jacqueline Su , Dr. Nikolai Stankiewicz, Anja Karolewiez,
Mareike Marten and Silke Kirchen for their advices and suggestions, and for their friend-
ship. I am also grateful to my desk colleague Markus Geis for being always so kind to
me.
For the nancial support of this work I would like to thank the European Union
PathogenCombat Project and the Institute of Functional Interfaces (IFG) at KIT Campus
Nord.
I am grateful to Johannes Knoll for his experimental input throughout the project, for
the shared hours in the lab and for giving me the opportunity to teach.
My very special thanks to Carla Calder on Rosas and Marcelo Gonzalez for their friend-
ship, their presence and for all the nice moments. Special thanks to my friends Ivana
Magario and Hern an Santa Cruz, for their support on CVT. I would like to thank Nora,
Martin, Jana, Caro, Feli and all my friends, for making me feel a little closer to my home.
I am also eternally grateful to my family.
Agradezco especialmente a mis padres Lidia y Jorge por creer en mi, por apoyarme
incondicionalmente y por haberme dado todo el amor del mundo. A mis hermanitos Fer
y Tincho por su eterno carino~ y dulzura y por ser muchas veces mi inspiraci on.
iiiA mis abuelos por su carino~ in nito y por la maravillosa familia que me dieron.
A la Mamina, a mis suegros Norma y Ricardo, y a mis cunados~ Julio y Silvia por el
apoyo, las fuerzas, la motivaci on, las buenas ondas y el gran carino~ que me dan.
Por ultimo quiero agradecer a la persona que me motiva desde el principio, a mi amor
Riqui. Por su apoyo incondicional, por su insuperable paciencia, por comprenderme y
contenerme en los momentos mas d ciles y por hacer que todos los d as sean especiales.
ivZusammenfassung
Mit Hilfe molekularbiologischer und damit kultivierungsunabh angiger Methoden wurden
pathogene Bakterien in Trinkwasser an hygienekritischen Kontrollpunkten entlang der
Fertigungsstrecke eines deutschen Molkereiunternehmens und eines spanischen Betriebes
fur Rohschinken nachgewiesen. Mit der denaturierenden Gradienten - Gelelektrophorese
(DGGE) konnten Ver anderungen in der bakteriellen Population beschrieben werden,
welche die biologische Instabilit at in Trinkwasser und in Bio lmpopulationen aufzeigen.
Autochthone Bakterien konnten durch Sequenzierung von DNA - Banden aus DGGE -
Gelen identi ziert werden. Fur genauere Untersuchungen wurden PCR und qPCR einge-
setzt, um eine Anzahl pathogener Bakterien (d.h. Listeria monocytogenes, Mycobac-
terium avium subsp. paratuberculosis, Campylobacter jejuni, Enterococcus spp., Salmo-
nella spp., Escherichia coli, und Pseudomonas aeruginosa) nachweisen zu k onnen.
Eine spezi sche Strategie wurde entwickelt, um hygienekritische Kontrollpunkte in den
Lebensmittelbetrieben zu ermitteln zu k onnen, an denen die technischen Voraussetzungen
fur Nachweise und die Erfassung und Vermeidung unerwunsc hter Polymerase - Inhibitoren
betrachtet wurden.
Die Populationen autochthoner Bakterien an den meisten Trinkwasser-Kontrollpunkten
stellten sich als au e rst stabil heraus. Nur ein Kontrollpunkt des deutschen Molkereiun-
ternehmens zeigte Ver anderungen in der Population. Enterokokken und Pseudomonas
aeruginosa konnten in einigen Wasserproben dieser Unternehmen mit molekularbiolo-
gischen Methoden nachgewiesen werden, nicht jedoch mit den herk ommlichen Kulti-
vierungsmethoden. Einige opportunistische Bakterien, wie Enterobacter sp., Acineto-
bacter, Sphingomonas sp. und apathogene Bacillus - Arten, wurden durch Sequenzierung
von DNA - Banden aus DGGE - Gelen identi ziert. In dem spanischen Rohschinken -
Unternehmen wurden keine Populationsverschiebungen gefunden, jedoch wurde P. aeru-
ginosa - DNA im Trinkwasser - und Bio lm - Proben detektiert.
DNA - basierte Methoden, die fur den Nachweis und die Charakterisierung von Bakte-
rien in Trinkwasser und in Trinkwasserbio lmen angewandt wurden, k onnen nicht zwi-
schen DNA von lebenden und toten Zellen unterscheiden. Eine Reihe kultivierungsun-
vZusammenfassung
abh angiger Methoden wurden erprobt, um dieses Problem zuosen.l
Es wurden Behandlungen der Proben mit Desoxyribonuclease I (DNase I) oder Pro-
pidiummonoazid (PMA) vor der Untersuchung mit DNA - basierten Methoden getestet,
optimiert und verglichen, um lebende von toten Bakterien in Trinkwasser und in Bio l-
men unterscheiden zu k onnen.
Die Vorbehandlung mit Desoxyribonuclease I / Proteinase K (DNase/PK) wurde fur
den Verdau von freier DNA und DNA von toten Zellen mit gesch adigten Zellmembranen
optimiert. Da diese Methode fur den Nachweis von Bakterien im Trinkwasser verwen-
det werden soll, wurden verschiedene Membran lter zur Aufkonzentrierung der Biomasse
aus den Wasserproben getestet. Untersucht wurde, ob die Membran lter die DNase/PK -
Behandlung in irgendeiner Weise beein ussen.
Nachdem die DNase/PK - Methode etabliert war, wurde sie mit lebenden und toten
Zellen und mit freier DNA getestet. Dafur wurde eine Mischung aus lebenden Zellen
von S. aureus, toten Zellen von P. aeruginosa und genomischer DNA von S. enterica
hergestellt. Aliquots dieser Mischung wurden vorbehandelt und anschlie end untersucht,
um die verschiedenen Vorgehen zu vergleichen. Die Populationsanalysen der Bakterien
wurde mit Hilfe der PCR - DGGE durchgefuhrt um die Proben ohne Vorbehandlung
(Gesamt - DNA) und mit Vorbehandlung durch DNase/PK oder PMA (DNA lebender
Zellen) zu vergleichen. Kultivierungsmethoden, quantitative PCR mit Sybr Green und 5 -
Cyano - 2,3 - Ditoryltetrazoliumchlorid (CTC)/4’ - 6 - Diamidin - 2 - Phenylindol (DAPI) -
F arbung wurden angewandt, um die F ahigkeit dieser Behandlungen zu veri zieren, dass
ausschlie lich DNA von lebenden Zellen nachgewiesen werden kann.
Im n achsten Schritt wurden die vershiedenen physiologischen Stadien von Bakterien
aus naturlic hen Trinkwasserbio lmen einer Pilotanlage in einem Wasserwerk bestimmt.
Ver anderungen im DNA - Muster, welche nach einer DGGE - Analyse sichtbar wurden,
zeigten: (i) die Anwendbarkeit der Behandlung von PMA und DNase/PK bei der Unter-
suchung naturlic her Bio lme; (ii) dass der Nachweis von DNA toter Bakterien und ex-
trazellul arer DNA durch die Vorbehandlung mit PMA oder DNase/PK erfolgreich unter-
bunden wird; und (iii) dass eine Behandlung mit DNase/PK eine deutlichere Auswirkung
auf die Unterscheidung von lebend und tot hat, aufgrund der gleichm a igen Wirkung des
Enzyms und durch das Wegfallen von Waschschritten w ahrend des Vorgehens.
Diese Arbeit fasst in einer Diskussion die verschiedenen Methoden zusammen, die
fur den Nachweis m oglicher hygienekritischer Kontrollpunkte verwendet wurden, ein-
schlie lich spezi scher Nachweise fur Pathogene in Wasser - und Bio lm - Proben und
viVer anderungen bakterieller Populationen der ausgew ahlten Kontrollpunkte innerhalb
eines Lebensmittelbetriebes. Einige m ogliche zukunftige Anwendungen wurden im Aus-
blick beschrieben.
viiAbstract
Culture - independent techniques were applied and optimized for the detection of patho-
genic bacteria in drinking water at potentially critical control points along the production
lines at a German dairy company and at a Spanish dry cured ham company. Denaturing
gradient gel electrophoresis (DGGE) was used to describe bacterial population shifts
indicating biological instability in drinking water and bio lm samples. Autochthonous
bacteria were identi ed by sequencing the DNA bands excised from the DGGE gels. More
speci cally, polymerase chain reaction (PCR) and quantitative PCR (qPCR) were applied
to detect a number of pathogenic bacteria, i.e. Listeria monocytogenes, Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis, Campylobacter jejuni, Enterococcus spp., Salmonella spp.,
Escherichia coli, and Pseudomonas aeruginosa.
A speci c strategy was established for the detection of possible water - derived critical
control points at the food companies, where the technical detection requirements and the
occurrence of unwanted polymerase inhibitions were contemplated.
Autochthonous bacterial populations were found to be highly stable at most of the
drink