Molecular mechanisms of gene activation and gene expression mediated by CCAAT, enhancer binding proteins [Elektronische Ressource] / von Katrin Zaragoza Dörr

Katrin Zaragoza Dörr

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• Publié le: 01 janvier 2008
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• Langue: English
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Extrait

Molecular Mechanisms of Gene Activation and Gene
Expression mediated by CCAAT/Enhancer Binding
Proteins
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie (Molekularbiologie)
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Humboldt-Universität zu Berlin
von
Frau Dipl.-Biochem. Katrin Zaragoza Dörr
geboren am 26.03.1979 in Mönchengladbach
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön
Gutachter:
1. Prof. Dr. Leutz
2. Prof. Dr. Saumweber
3. Prof. Dr. Sommer
eingereicht am: 25. Juni 2008
Tag der mündlichen Prüfung: 16. Oktober 2008Abstract
The transcription factor CCAAT/Enhancer-Binding Protein α (C/EBPα) coordinates pro-
liferation arrest and differentiation of myeloid progenitors and adipocytes. C/EBPα acts as
a transcriptional activator of lineage specific genes and blocks the cell cycle by repress-
ing transcription of E2F-regulated genes. Data presented here suggest that also inversely
E2F interferes with the transcriptional activity of C/EBPα, counteracting C/EBPα-mediated
differentiation processes. Thus, E2F-C/EBPα are part of a switch mechanism between pro-
liferation and differentiation. The mechanism by which E2F suppresses C/EBPα-mediated
transactivation is novel in several aspects. This is the first time that E2F has been shown to
actasaco-repressorofanothertranscriptionfactor. E2FrepressesC/EBPαwithoutbinding
to cis-regulatory elements, but by direct protein-protein interactions that abolish the bind-
ing of C/EBPα to DNA. This mechanism of transcriptional repression occurs independent
of pocket proteins. Disturbed DNA binding of C/EBPα is often observed in AML patients
suggesting a causative role in granulocytic disorders. Thus, it would be of main interest to
analyze whether E2F mediates disruption of C/EBPα’s DNA-binding in AML patients and
whether therapies directed against E2F could restore granulocytic maturation.
Despite the extensive knowledge of mechanisms involved in the inhibitory function of
C/EBPα,ithasnotbeenaddressedwhetherC/EBPαmayimpingeoncellproliferationbyaf-
fectingtheribosomalbiogenesisofacell. ThisworkdemonstratesanassociationofC/EBPα
totheRNAPolItranscriptionfactorUBF1,bothproteinsretainedinlargechromosomalfoci.
Similarities to other focal structures associated to UBF1, suggest that C/EBPα may repress
transcriptionofPolI-transcribedrRNAgenes,andthusaffectribosomalbiogenesis. Theen-
richmentofC/EBPαatsitesofUBF1isinducedbythehistonemethyltransferaseSUV39H1.
Thus, C/EBPα may not only control lineage commitment and cell proliferation by regulating
genes transcribed by RNA Pol II, but also may act as a repressor of RNA Pol I mediated
rRNA synthesis.
Keywords:
C/EBPα, E2F, Differentiation, SUV39H1Zusammenfassung
DerTranskriptionsfaktorCCAAT/Enhancer-BindingProteinα(C/EBPα)koordiniertProlifera-
tionshemmungundDifferenzierungvonmyeloidenVorläuferzellenundAdipozyten.C/EBPα
funktioniertalseintranskriptionellerAktivatorvonabstammungspezifischenGenenundblo-
ckiert den Zellzyklus durch Repression von proliferationsfördernden E2F Zielgenen. Die in
dieserArbeitgezeigtenDatenzeigen,dassauchumgekehrtE2FdietranskriptionelleAktivi-
tät von C/EBPα verhindert und somit C/EBPα abhängigen Differenzierungsprozessen ent-
gegenwirkt. Somit besitzen E2F-C/EBPα eine zentrale Schalterfunktion zwischen Prolifera-
tion und Differenzierung. Der Repressionsmechanismus durch E2F ist in mehreren Aspek-
ten neuartig: Zum erstenmal wurde gezeigt, dass E2F einen anderen Transkriptionsfaktor
reprimieren kann. E2F reprimiert die transkriptionelle Aktivität von C/EBPα ohne Bindung
an cis-regulatorischen Elemente, sondern durch direkte Protein-Protein Interaktionen, die
die Bindung von C/EBPα an DNA verhindern. Diese Form der transkriptionellen Repressi-
ongeschiehtunabhängigvon”Pocket-Proteinen”.PatientenmitAkuterMyeloidenLeukämie
(AML)weisenhäufigeinegestörteDNABindungvonC/EBPαauf,welcheursachlichfürgra-
nulozitären Funktionsstörungen sein könnte. Daher wäre es wichtig zu analysieren ob E2F
die DNA Bindung von C/EBPα in AML Patienten beeinträchtigt und ob auf E2F gerichtete
Therapien granulozitäre Reifung wiederherstellen.
Trotz der vielen Mechanismen der Blockierung von Zellproliferation durch C/EBPα, ist
es bislang unbekannt ob C/EBPα die ribosomale Biogenese einer Zelle beinflussen kann.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass C/EBPα mit UBF1, dem Co-Aktivator der RNA Poly-
merase I, an chromosomalen Foci positioniert wird. Eine Ähnlichkeit zu anderen fokalen
Strukturen suggeriert, dass C/EBPα die Transkription von Polymerase I regulierten rRNA
GenereprimierenundsomitribosomaleBiogenesebeeinträchtigenkönnte.DieAssoziation
zwischen C/EBPα und UBF1 wird durch die Histon-Methyltransferase SUV39H1 stimuliert.
Demnach könnte die antiproliferative Funktion von C/EBPα nicht nur auf der Regulierung
von RNA Pol II-abhängiger Transkription, sondern auch auf der Repression von RNA Pol I
regulierter rRNA Synthese basieren.
Schlagwörter:
C/EBPα, E2F, Differenzierung, SUV39H1Im Grunde genommen ist Wissenschaft wie jede gewöhnliche kriminellen Aktivität:
Sie bedarf einer guten Planung, Ausdauer und eines Quäntchens Glück!
Dominik Nagl
ivContents
1 Introduction 1
1.1 The C/EBP Family . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1 C/EBPα . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.2 C/EBPα and cell cycle arrest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.1.3 Signaling to C/EBPα . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2 The E2F Family . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.1 Functions of E2Fs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3 E2F and C/EBPα in diseases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.4 The Methyltransferase SUV39H1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.4.1 Histone modifications and transcriptional control . . . . . . . . . . . . 14
1.4.2 SET-domain methyltransferase SUV39H . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.4.3 Senescence and lymphomagenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2 Materialsandmethods 19
2.1 General equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2 Working with DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2.1 Reagents and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2.2 Transformation ofE.coli using the Nishimura Heat-Shock protocol . . 22
2.2.3 DNA isolation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2.4 Restriction Endonuclease digestion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2.5 Polymerase-Chain-Reaction (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2.6 Agarose Gel Electrophoresis and DNA Extraction from Agarose Gel . 23
2.2.7 Plasmids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2.8 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.3 Working with proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.1 Reagents and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.2 Cell protein extracts, SDS-PAGE and Immunoblotting . . . . . . . . . 29
vCONTENTS CONTENTS
2.3.3 Nuclear extracts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.3.4 Relative protein concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.3.5 Co-immunoprecipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.3.6 In vitro transcription/translation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.3.7 Bacterial expression of GST-fusion proteins . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.3.8 GST-pulldown . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.4 Cell culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.4.1 Reagents, solutions and cell lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.4.2 Growth of Mammalian Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.4.3 Freezing and thawing of cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.4.4 Transfection with CaPO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354
2.4.5 Liposomal transfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.4.6 Reporter assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.4.7 Retroviral infection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.4.8 Small interference RNA (siRNA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.4.9 Fluorescence activated cell sorter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.4.10 Adipogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.4.11 of shRNA-expressing cells . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.4.12 Oil-Red-O staining . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.4.13 Colony Forming Assay and Crystal violet staining . . . . . . . . . . . . 40
2.4.14 Immunofluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .