New perspectives on the evolution of B-lymphocytes in germinal centers [Elektronische Ressource] / von Nicole Wittenbrink

Wittenbrink Nicole

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• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 13
• Langue: English
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Extrait

New perspectives on the evolution of
B-lymphocytes in germinal centers
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Humboldt-Universität zu Berlin
von
Frau Dipl.-Ing. Nicole Wittenbrink
geboren am 19.08.1975 in Gütersloh
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Dr. Christian Limberg
Gutachter:
1. Dr. Michal Or-Guil
2. PD Dr. Rudolf Manz
3. Prof. Dr. Hans-Dieter Volk
eingereicht am: 21. Mai 2007
Tag der mündlichen Prüfung: 21. November 2007One cannot divine nor forcast the conditions that will make happiness; one only
stumbles upon them by chance, in a lucky hour, at the world’s end somewhere, and
holds fast to the days, as to fortune or fame.
Willa Cather, Le Levandou, 1902Abstract
Central to the humoral immune response is the commonly observed improvement of
antibody affinity over time, a phenomenon referred to as affinity maturation.
Affinitymaturationtakesplaceinso-calledgerminalcenters (GC)thataretran-
siently formed in secondary lymphoid tissues (e.g. spleen) following immunization
with T cell-dependent antigens. Within GC, B lymphocytes are subjected to a
micro-evolutionary process that includes multiple rounds of diversification of their
B cell receptors (BCRs) by somatic hypermutation (SHM) and subsequent selec-
tion of those B cells showing improved binding characteristics towards the antigen.
However, despite recent advances in defining the mechanisms contributing to di-
versification of B lymphocytes within GC, the dynamics, mechanisms and forces of
their selection are poorly understood. The current thesis aims at providing new
insights into the evolution of B cells within GC by assessing the overall GC growth
behavior (Chapter 4), by documenting changes of the cellular composition of GC
over time 5) and by, for the first time, specifying the kinetics (Chapter 5)
and sequence properties (Chapter 6) of negative selection occurring within GC.
The results obtained during cross-sectional evaluation of spleen sections revealed a
robust average growth kinetics of GC, that was, however, based on a notable size
distribution of GC within individual sections. This could not be explained by ran-
dom sectioning of GC. However, simulations of random sectioning of hypothetical
ensemble kinetics have shown that the experimentally recorded cross-sectional pro-
file of GC growth is consistent with others than the accepted notion. To solve this
problem, GC growth was subsequently addressed by three-dimensional volumetric
evaluation of splenic GC, that finally contradicted the accepted notion by revealing
non-synchronized formation and growth of GC as characterized by ongoing new for-
mation and marked, broad volume distributions of GC. According to these findings,
a revised model of affinity maturation was proposed that involves recirculation of
GC emigrant B cells and a multilevel selection strategy (intercalation of local and
global selection).
It was further shown that the kinetics of GC T cells and macrophages follow the
overall growth kinetics of GC. However, whereas T cells populated B cell zones not
until antigenic challenge, macrophages already represented a constituent cell pop-
ulation of primary B cell follicles. Noteworthy, the number of macrophages was
found to strictly correlate with the underlying size of B cell zones. In this context,
an acquired imbalance due to phagocytosis-induced macrophage death was further
shown to be associated with disease progression in the NZB/W autoimmune mouse
model of systemic lupus erythematosus (SLE). Furthermore, costaining of macro-
phages and apoptotic cells revealed that cell death occurs throughout GC, thereby
indicating that selection takes place in both, dark and light zones of GC.
The establishment of a reliable method for recovery of primary BCR sequences of
phagocytosed GC B cells has proven to be powerful, in that it provides new insights
into the selection process of GC B cells by, for the first time, allowing for accessto yet unexplored negatively selected GC B cells. In this context, the tradition-
ally proposed molecular signatures - as for instance the distribution of mutations
within framework (FR) and complementary determining regions (CDRs), ratios of
replacement (R) to silent mutations (S) and the incidence of key mutations - were
all shown to fail to demarcate winners and losers of selection. The obtained results
indicated that the survival fate of GC B cells is governed by the cumulative effect of
replacement mutations within CDRs, though, in which the as yet proposed positive
effect of R m turned out to be overemphasized. By contrast, R mutations in
CDRs turned out to possess marked deleterious effects, thereby lending support to
the proposition that survival of GC B cells is particularly driven by the absence of
excess mutations within CDRs that have an adverse effect with respect to antigen
binding. Moreover, the high interclonal diversity of phagocytosed B cell fractions
demonstrated that interclonal competition is sustained throughout the GC response
most probably incited by ongoing replenishment of the pool of interacting B cells.
Finally, this finding closes the circle to the central asssumption of the revised model
of affinity maturation, that is recirculation of GC emigrant B cells.
In conclusion, the current thesis provides new insights into the evolution of B cells
within GC by proposing:
• non-synchronized GC formation and growth
• a multilevel selection strategy (intercalation of local and global selection by
recirculation of GC emigrant B cells)
• a central role for macrophages in retaining germinal center B cell homeostasis
and preventing autoimmunity
• thefailureofcommonlysupposedmolecularsignaturestodemarcatepositively
and negatively selected B cells
• survivalfateofGCBcellsisparticularlydrivenbyabsenceofexcessmutations
within CDRs that have an adverse effect with respect to antigen binding
Keywords:
B lymphocytes, affinity maturation, germinal center, selection
ivZusammenfassung
Ein zentrales Merkmal der humoralen Antwort ist die im Laufe der Zeit ansteigende
Affinität der Antikörper gegenüber dem Antigen, ein Phänomen, das man generell
als Affinitätsreifung bezeichnet. Die Affinitätsreifung von Antikörpern ist an
die transiente Ausbildung von Keimzentren gebunden, die man nach Immuni-
sierung mit einem T-Zell-abhängigen Antigen in sekundär lymphatischen Geweben
wie der Milz beobachtet. Innerhalb der Keimzentren durchlaufen B-Zellen einen
mikro-evolutionären Prozess, in dessen Verlauf es zu einer Diversifizierung der von
den B-Zellen kodierten B-Zell-Rezeptoren durch somatische Hypermutation und an-
schließenderSelektion derjenigen B-Zellen mit den besten Bindungseigenschaften
gegenüber dem Antigen kommt. In den letzten Jahren waren große Fortschritte hin-
sichtlich der Aufklärung der molekularen Mechanismen die zur Diversifizierung der
B-Zell-Rezeptoren beitragen zu verzeichnen, wohingegen die Dynamik, der Mecha-
nismus und die treibenden Kräfte der Selektion bisher weitgehend unverstanden
sind. Das Ziel dieser Arbeit ist es zum Verständnis der Evolution von B-Zellen in
Keimzentren beizutragen. Aus diesem Grund wurden das Wachstumsverhalten vontren (Kapitel 4) und die Veränderung der zellulären Zusammensetzung von
Keimzentren 5) untersucht. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit zum ers-
ten Mal auch die Kinetik der negativen Selektion (Kapitel 5) aufgenommen sowie
die B-Zell-Rezeptor Sequenzen von negativ selektierten Keimzentrums B-Zellen ana-
lysiert (Kapitel 6).
Anhand der Auswertung von Milzschnitten konnte eine robuste mittlere Größen-
kinetik von Keimzentrumsflächen nachgewiesen werden, die jedoch auf einer aus-
geprägten Größenverteilung von Keimzentren innerhalb der einzelnen Schnitte be-
ruhte. Diese ließ sich nicht durch zufälliges Anschneiden der Keimzentren erklären.
Des Weiteren wurde anhand von Simulationen gezeigt, dass das Profil der experi-
mentell aufgenommenen Größenverteilungen von Keimzentren nicht nur mit dem
traditionell angenommenen synchronisierten Wachtumsverhalten von Keimzentren,
sondern auch mit anderen hypothetischen Wachstumskinetiken übereinstimmt. Die
anschließend durchgeführte dreidimensionale, volumetrische Analyse hat gezeigt,
dass das Wachstumverhalten von Keimzentren - anders als bisher angenommen -
nicht-synchronisiert ist und sich durch fortgesetzte Neuformation und beträchtliche
Volumenverteilungen von Keimzentren auszeichnet. Auf Grundlage dieser Ergebnis-
se wurde ein neues, überarbeitetes Modell der Affinitätsreifung entwickelt, dessen
Hauptmerkmale die Rezirkulation von ausgewanderten Keimzentrums-B-Zellen so-
wie die zusätzliche Einführung eines globalen Selektionsprozesses sind.
Es wurde weiterhin gezeigt, dass die Kinetiken von Keimzentrums-T-Zellen und
Makrophagen der mittleren Gesamtwachstumskinetik der Keimzentren folgen. Die
Besiedlung der B-Zell-Zonen durch T-Zellen setzte erst nach der Immunisierung ein,
dage