New procedures for the diagnosis of human brucellosis in Mongolia [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Zandraa Jamba

Sujets

• Gesundheit

Informations

• Publié par: justus-liebig-universitat_giessen
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 28
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

New Procedures for the Diagnosis of Human
Brucellosis in Mongolia








Inauguraldissertation
zur
Erlangung des Grades eines Doktors der Humanbiologie
des Fachbereichs Medizin
der Justus-Liebig-Universität Giessen













vorgelegt von

Zandraa Jamba

aus Ulaanbaatar, Mongolei






Giessen 2008





I



Aus dem Biochemischen Institut
des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Giessen


Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. Klaus T. Preissner





















Gutachter: Prof. Dr. Ewald Beck

Gutachter: Prof. Dr. Rolf Bauerfeind


Tag der Disputation: 24.06.2008

II SUMMARY
The feasibility of developing immunological and molecular diagnostic tools for routine diagnosis
of brucellosis under conditions of a less economically and scientifically advanced country in
general and Mongolia in particular was analysed. Brucellosis is a major healthcare issue in
Mongolia for both, humans as well as lifestock farming, leading to enormous economic losses
every year. Diagnosis of the disease is demanding and insufficiently specific with the available
tests. Using genomic sequences of the most important Brucella strains, new diagnostic
procedures have been developed by means of molecular biotechnology. They include the
production of several recombinant proteins as antigens in immunological assays such as
ELISA. Combining of several of these antigens in a single recombinant fusion protein led to an
unattained highly specific test for infections caused by Brucella. The genus Brucella includes
different species (or biovars) carried by different primary animal hosts and being transmitted by
different routes to humans. Furthermore, the severity of clinical manifestations differs among the
species necessitating specific modalities of treatment and making differential diagnosis on the
species level an important issue. Thus, another part of the study was focused on this topic. By
means of multiplex nested PCR, a highly sensitive and specific differentiation between the
major Brucella strains occurring in Mongolia was obtained. The immunological as well as the
molecular diagnostic principles have been designed to be applicable in laboratory practice
under limited economical conditions, including simple and inexpensive procedures for antigen
production and DNA purification.



III ZUSAMMENFASSUNG
Ziel der Arbeit war zu versuchen, neue immunologische und molekulare Methoden zur
routinemäßigen Diagnose der Brucellose unter wirtschaftlich und wissenschaftlich weniger
privilegierten Bedingung zu entwickeln, wie sie z. B. in der Mongolei vorherrschen. Die
Brucellose ist in der Mongolei ein erhebliches Problem, das nicht nur die Gesundheit der
Bevölkerung betrifft, sondern auch für die Tierzucht relevant ist und dort jedes Jahr zu großen
ökonomischen Einbußen führt. Die Diagnose der Krankheit ist aufwendig und mit den
vorhandenen Methoden wenig spezifisch. In der vorliegenden Arbeit wurden unter
Zuhilfenahme der genomischen Sequenzen der wichtigsten Stämme von Brucella mittels
molekularbiologischer Methoden neue Diagnoseverfahren entwickelt. Auf der einen Seite waren
dies verschiedene rekombinante Antigene, die in immunologischen Tests wie dem ELISA zur
Anwendung kamen. Die Verschmelzung mehrerer solcher rekombinanter Antigene in einem
einzigen rekombinanten Fusionsprotein führte zu einer bislang unerreicht hohen Spezifität der
Diagnose der Brucellose. Das Genus Brucella schließt mehrere Species (oder Biovare) ein,
die bei verschiedenen Tierarten vorkommen und auf unterschiedliche Weisen auf den
Menschen übertragen werden. Die Schwere der klinischen Manifestationen hängt von der Art
des Erregers ab und bedingt unterschiedliche therapeutische Maßnahmen. Daher ist es wichtig,
die Art der Erreger durch eine Differentialdiagnose zu identifizieren. Ein weiterer Teil der Arbeit
befaßt sich daher mit diesem Problem. Mit Hilfe von Multiplex-PCR wurde eine sehr
empfindliche und spezifische Differenzierung zwischen den wichtigsten in der Mongolei
auftretenden Brucella-Stämmem erzielt. Sowohl das immunologische als auch das molekulare
diagnostische Nachweisverfahren wurden so entwickelt, daß sie unter den bezüglich der
Finanzierung und der wissenschaftlichen Laborausstattung limitierten Voraussetzungen der
Mongolei durchführbar sind. Dies betrifft z. B. die Verwendung einfacher und kostengünstiger
Methoden für die Produktion der Antigene für die Immundiagnose und für die Reinigung von
DNA für PCR-Analysen.

IV
CONTENTS
ABBREVIATIONS III
1 INTRODUCTION 1
1.1. General facts about brucellosis 1
1.1.2 Brucella species: taxonomy, structure and biochemical characteristics 1
1.1.3 Virulence and pathogenesis 4
1.1.4 Immune response 6
1.1.5 Clinical spectrum of Brucella infection 8
1.1.6 Treatment 9
1.1.7 Control and prevention 10
1.1.8 Epidemiology of brucellosis worldwide 12
1.1.9 Brucellosis in Mongolia 15
1.2. Diagnostic methods for brucellosis 18
1.2.1 Clinical diagnosis 18
1.2.2 Laboratory diagnosis 19
1.2.2.1 Bacterial culture 20
1.2.2.2 Immunological methods 21
1.2.2.3 Molecular methods 23
1.3 Goals and objectives of the study 25
2 MATERIALS AND METHODS 27
2.1 Instruments 27
2.2 Materials 28
2.2.1 Chemicals 28
2.2.2 Bacterial strains 30
2.2.3 Bacterial DNAs 30
2.2.4 Antisera 31
2.2.5 Enzymes 31
2.3 Buffers and solutions 32
2.3.1 Buffers and solutions for protein gel electrophoresis 32
2.3.2 Buffers and solutions for DNA gel electrophoresis 32
2.3.3 Buffers and solutions for methods of molecular biology 33
2.3.4 Buffers for total DNA extraction 34
2.3.5 Buffers for alkaline lysis/silica method for plasmid preparation 34
® 2.3.6 Buffers for purification of His-tagged proteins with TALON 35
2.3.7 Buffers for immunoassays 35
I 2.4 Methods 37
2.4.1 DNA purification 37
2.4.2 Purification of recombinant Taq DNA polymerase 39
2.4.3 Standard cleavage assay 40
2.4.4 Standard ligation assay 40
2.4.5 Transformation of E. coli cells by electroporation 40
2.4.6 Expression and purification of His-tagged proteins 41
2.4.7 Line blot 42
2.4.8 ELISA 43
2.4.9 PCR procedures 44
2.4.10 Gel electrophoresis 45
2.4.11 Serological tests for brucellosis 46
3 RESULTS