Optimal de-excitation patterns for RESOLFT microscopy [Elektronische Ressource] / presented by Jan Keller

Jan Keller

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• Naturwissenschaften

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• Publié par: ruprecht-karls-universitat_heidelberg
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 12
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

Dissertation
submittedtothe
CombinedFacultiesfortheNaturalSciencesandforMathematics
oftheRuperto CarolaUniversityofHeidelberg,Germany
forthedegreeof
DoctorofNaturalSciences
presentedby
Diplom PhysikerJanKeller
borninLeipzig
Oralexamination: October18th,2006Optimalde excitationpatterns
forRESOLFT Microscopy
Referees: Prof. Dr. StefanW.Hell
Prof. Dr. JosefBilleAbstract
RESOLFTmicroscopy hasbeenthe firstmethodthat iscapableof non invasivelyresolving
threedimensionalstructureswithrealsubdiffractionresolutionusingvisiblelight. Itexploits
the strong nonlinear saturation of a reversible optical transition. A focal intensity pattern is
essential that de excites or de activates dyes outside the remaining ultrasharp effective fo
cal spot. For a given amount of available power, the steepest applied de excitation pattern
will yield the highest resolution. In this thesis, for the first time, a comprehensive search,
optimization and characterization of de excitation patterns is performed. The microscope’s
pupil function is decomposed into orthonormal polynomials which allows the restriction of
the space of pupil functions so that boundary conditions are fulfilled. The chosen global
optimization algorithm converges reasonably well to pupil functions that can be idealized
furthertosimpleshapes. Optimalpupilfunctionsarefoundaccordingtoassumptionsmade
about the practical limitations. The optimization identified a novel, superior de excitation
pattern for circularly polarized light. Its experimental application has led to a hitherto unri
valedlateralresolutionofdownto20nminbiologicalsystems. Itisshownthatanefficient
resolution increase in all spatial directions is only possible by incoherent combinations of
de excitation beams. The optimal choice for current experimental conditions is identified.
Finally, a new concept for fast acquisition of high resolution images is developed that is
based on the simultaneous creation of compact arrays of sub diffraction sized fluorescence
spots in the sample. An optical setup that can generate the corresponding complex pupil
functionsisdetailed.
Zusammenfassung
RESOLFTMikroskopiewardieersteMethode,welchenichtinvasivdreidimensionaleStruk
turen mit Hilfe sichtbaren Lichts deutlich unterhalb des Beugungslimits auflösen konnte.
Dabei wird die starke nichtlineare Sättigung von reversiblen optischen Übergängen aus
genutzt. Eine fokale Intensitätsverteilung wird benötigt, um Farbstoffe außerhalb eines
verbleibenden,sehrscharfeneffektivenFokusabzuregenoderzudeaktivieren. Beigegebener
Stärke der vorhandenen Leistung wird mit der steilsten Intensitätsverteilungen die höchste
Auflösung erzielt. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal eine ausführliche Suche, Opti
mierungundCharakterisierungvonIntensitätsverteilungendurchgeführt. DiePupillenfunk
tiondesMikroskopswirddabeiinorthonormalePolynomezerlegt. DadurchkannderRaum
all dieser Funktionen den Randbedingungen entsprechend eingeschränkt werden. Der aus
gewählteglobaleOptimierungsalgorithmskonvergiertsoweit,dassdieerhaltenenPupillen
funktionen zu einfachen Formen idealisiert werden können. Für verschiedene Annahmen
überlimitierendeFaktorenwurdenoptimalePupillenfunktionengefunden. DieOptimierung
ergab eine neue, verbesserte Intensitätsverteilung, die zirkular polarisiertes Licht benutzt.
Ihre experimentelle Realisierung hat zu einer bis dahin unerreichten Auflösung von bis zu
20 nm in biologischen Systemen geführt. Es wird gezeigt, dass eine effiziente Erhöhung
der Auflösung in allen Raumrichtungen nur durch inkohärente Kombinationen von Inten
sitätsverteilungen möglich ist. Die optimale Wahl unter derzeitigen experimentellen Be
dingungen wurde gefunden. Desweiteren wurde ein neues Konzept zur schnellen Akquisi
tionhochaufgelösterBilderentwickelt,welchesaufdergleichzeitigenErzeugungkompakter
AnordnungenvonfluoreszierendenFokiunterhalbdesBeugungslimitsberuht. Einoptischer
Aufbau, welcher die dazugehörenden komplexen Pupillenfunktionen erzeugen kann, wird
detailliertbeschrieben.
iAbbreviations
⊗ convolutionoftwofunctions
? cross correlationoftwofunctions
1D one dimensional
2D two dimensional
3D three dimensional
4Pi microscopy microscopyusingtwoopposinglensesinacoherentway
cw continuouswave
Exc excitation
Eff effective
Em emission
d distancefromfocusthatcorrespondstotheexpectedresolutionER
Det detection
FoM figure of merit
FWHM fullwidthathalfmaximum
GSD groundstatedepletion
MMM multifocalmulti photonmicroscopy
NA numericalapertureofalens(NA= nsinα)
OTF opticaltransferfunction,FouriertransformofthePSF
(PAL )SLM (parallel alignednematicliquidcrystal)spatiallightmodulator
PSF pointspreadfunction
I PSF intensitypointspreadfunction
A PSF amplitudepointspread
RESOLFT reversiblesaturableoptical(fluorescence)transitions
SNOM scanningnear fieldmicroscopy
SNR signaltonoiseratio
STED stimulatedemissiondepletion
TIRF totalinternalreflectionfluorescence
OPO opticalparametricoscillator
UV ultraviolet(light)
standardconditions aplanaticlens,
λ = λ = 500nm,λ = 700nmExc Det RESOLFT
n = 1.333,sin(α) = 0.9W
iiContents
1 Introduction 1
2 TheoreticalFoundations 4
2.1 ImageFormation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.2 ResolutionofaLightScanningMicroscope . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.3 IntroductiontoRESOLFT typeMicroscopes . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.4 VectorialImageFormationinaRESOLFTMicroscope . . . . . . . . . . . 13
2.5 EngineeringFocalIntensityDistributions . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.5.1 CalculationoftheFocalField . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.5.2 TheOptimizationSpaceanditsBasis . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.5.3 ConstructingSubspacesProvidingStrictIntensityZeros . . . . . . 22
3 OptimalSingleFocusDe ExcitationPatterns 25
3.1 OptimizationAlgorithm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.2Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.2.1 LimitedAmplitude(A) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.2.2Power(B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.2.3 Limitedfocalintensity(C) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.3 Ideal3DDe ExcitationPatterns . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.4 HighestPossibleResolutionIncrease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.5 Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.6 Z OrientedMolecules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4 MultifocalRESOLFTMicroscopy 50
4.1 FastScanning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.2 MultifocalArrangements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.3 OptimizationAlgorithm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.4 Results. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.4.1 ExpectedResolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.5 GenerationofGeneralComplexApodizations . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5 Conclusionandoutlook 64
Bibliography 66
iiiA Appendix 74
A.1 ZernikePolynomials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
A.1.1 CompletenessandOrthogonality . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
A.1.2 EfficientCalculationofZernikePolynomials . . . . . . . . . . . . 74
A.2 SingularValueDecomposition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
A.3 GlobalOptimizationMethod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
A.4 Coherent3DDe ExcitationPatterns . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
A.5 AdditionalOptimizationResults . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
A.6 De ExcitationPatternsfor4Pi Microscopes . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
iv“Ipreferknowingthecauseofasingle
thingtobeingkingofPersia.”
Democritos
1 Introduction
Theapplicationofopticsinscienceisahistoryofgroundbreakinginsights. Opticsisapplied
across many different disciplines. E.g., some years ago the Deep Field project with the
Hubble telescope [1] provided an unprecedented sharp view of a part of the sky with at
least 1500 galaxies at various stages of evolution. At the other end of the length scale,
microscopy advanced as well. Already in 1839, optics revealed parts of the microscosmos
when Schwann and Schleiden developed a cell theory by using the microscope [2]. After
years of development, the utilization of optics in modern science is represented by works
suchasthedisclosureoftheembryonicdevelopmentofzebrafishonamicroscopicscale[3]
- one of the works awarded with the Nobel prize. Also, the distribution of various proteins
couldberesolvedatthesubcellularscale[4]. Enhancingtheresolutionoflightmicroscopes
furtherwouldbeabigsteptowardamorefundamentalunderstandingofnaturewhichisthe
ultimategoalofallworkpresentedinthisdissertation.
Far field light microscopy non invasively delivers three dimensional images of living
cells. Highly specific fluorescent markers allow functional imaging because different dyes
can be attached to different structures in the cell, specific molecules or even certain sites of
macromolecules [5]. The development of more versatile, functionalized marke