Organisation moléculaire et réponse au stress de la voie de biosynthèse des phospholipides chez Esherichia coli, Molecular organization and stress response of the phospholipid biosynthesis pathway in Escherichia coli

Astrid Wahl

Description

Sous la direction de James Sturgis, Emmanuelle Bouveret
Thèse soutenue le 20 octobre 2010: Aix Marseille 2
Les phospholipides sont à la base de l’architecture de la membrane plasmique bactérienne. La composition de celle-ci est en permanence contrôlée par les conditions extérieures afin d’adapter sa fluidité et maintenir l’homéostasie. Les différentes étapes de la voie de biosynthèse des phospholipides dans la membrane interne de E. coli sont bien connues. En revanche, on connaît peu l’organisation supramoléculaire et la régulation génétique des enzymes, ce qui correspond aux deux grands axes de recherche développés dans cette thèse.Des études par double hybride bactérien ont mis en évidence un réseau d’interactions protéine-protéine,suggérant l’existence d’un complexe formé par les enzymes de la synthèse des phospholipides dans la membrane. Pour tester cette hypothèse, j’ai voulu étudier ces interactions en conditions natives, en utilisant des techniques comme le FRET, le BRET ou la purification TAP. Pour cela, j’ai développé de nouvelles cassettes permettant la construction systématique de souches de E.coli produisant des protéines étiquetées avec des rapporteurs fluorescents ou des tags d’affinité, en condition d’expression physiologique. Ceci m’a permis d’étudier la localisation et la stoechiométrie des enzymes de synthèse des phospholipides dans la membrane.J’ai également étudié la régulation en réponse au stress du gène plsB, qui code pour la première enzyme de la voie de biosynthèse des phospholipides, et de dgkA, qui code pour une diacylglycerolkinase permettant le recyclage des phospholipides. Ces deux gènes, divergents sur le chromosome,sont régulés de façon antagoniste en réponse à trois types de stress : le facteur de réponse au stress extracytoplasmique σE active plsB et inhibe dgkA; le système à deux composants BasRS active dgkAet inhibe plsB ; la réponse stringente active dgkA et inhibe plsB. Ces résultats montrent que le locusplsB-dgkA est finement régulé par toute une série de régulateurs qui intègrent des signaux de stress multiples afin de contrôler l’activité de la voie de biosynthèse des phospholipides
-Phospholipides
-Interactions protéine-protéine
-Métabolisme des lipides
-Escherichia coli
-Reponse au stress
-BasRS
Phospholipids are the building blocks of the bacterial plasmic membrane. The composition of the membrane is continuously controlled by environment conditions, in order to adapt its fluidity and maintain the homeostasis. The enzymatic steps of the phospholipid synthesis pathway in the intermembrane of E. coli are well known. However, little is known about the supramolecular organizationand the genetic regulation of the enzymes catalyzing these reactions, these questions constituting the two main axes developed in this thesis.Two-hybrid studies have evidenced a network of protein-protein interactions, suggesting the existence of a membrane protein complex formed by phospholipid synthesis enzymes. To test this hypothesis, I wanted to assay these interactions in native conditions, by using techniques such as FRET, BRET or Tandem Affinity Purification. Toward this goal, I have developed novel cassettes permitting tosystematically construct E. coli strains that produce proteins tagged with fluorescent or affinity tags,under physiological expression. This allowed me to study the localization and stoechiometry of phospholipid synthesis enzymes in the membrane. Furthermore, I have studied the regulation in response to stress of the plsB gene that codes for the firstenzyme of the phospholipid synthesis pathway, and of dgkA that codes for a diacylglycerol kinase that recycles phospholipids. These two neighboring and divergent genes are inversely regulated in response to three stress responses: the extracellular stress σE factor activates plsB and inhibits dgkA; the two componentsystem BasRS activates dgkA and inhibits plsB; stringent response activates dgkA andinhibits plsB. These results show that the plsB-dgkA locus is regulated by a series of regulators that integrate multiple stress signals, in order to control the activity of the phospholipids synthesis pathway
Source: http://www.theses.fr/2010AIX22092/document

Sujets

• Phospholipide

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 23
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 9 Mo

Extrait

UNIVERSITÉ AIX-MARSEILLE II
Centre National de la Recherche Scientifique
Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Macromoléculaires

THÈSE
de Microbiologie Moléculaire et Biotechnologie
pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université Aix-Marseille II
Présentée et soutenue par

Astrid WAHL

le 20 octobre 2010


L’Organisation moléculaire et la Réponse au Stress de la Voie de
Biosynthèse des Phospholipides chez Escherichia coli



Membres du Jury :
Dr. Didier Zerbib Rapporteur
Pr. Carlos Blanco Rapporteur
Dr. Mireille Ansaldi Présidente du Jury
Pr. James N. Sturgis Co-directeur de thèse
Dr. Emmanuelle Bouveret Co-directrice de thèse Résumé
Les phospholipides sont à la base de l’architecture de la membrane plasmique bactérienne. La
composition de celle-ci est en permanence contrôlée par les conditions extérieures afin d’adapter sa
fluidité et maintenir l’homéostasie. Les différentes étapes de la voie de biosynthèse des phospholipides
dans la membrane interne de E. coli sont bien connues. En revanche, on connaît peu l’organisation
supramoléculaire et la régulation génétique des enzymes, ce qui correspond aux deux grands axes de
recherche développés dans cette thèse.
Des études par double hybride bactérien ont mis en évidence un réseau d’interactions protéine-
protéine, suggérant l’existence d’un complexe formé par les enzymes de la synthèse des
phospholipides dans la membrane. Pour tester cette hypothèse, j’ai voulu étudier ces interactions en
conditions natives, en utilisant des techniques comme le FRET, le BRET ou la purification TAP. Pour
cela, j’ai développé de nouvelles cassettes permettant la construction systématique de souches de E.
coli produisant des protéines étiquetées avec des rapporteurs fluorescents ou des tags d’affinité, en
condition d’expression physiologique. Ceci m’a permis d’étudier la localisation et la stœchiométrie des
enzymes de synthèse des phospholipides dans la membrane.
J’ai également étudié la régulation en réponse au stress du gène plsB, qui code pour la première
enzyme de la voie de biosynthèse des phospholipides, et de dgkA, qui code pour une diacylglycerol
kinase permettant le recyclage des ipides. Ces deux gènes, divergents sur le chromosome,
sont régulés de façon antagoniste en réponse à trois types de stress : le facteur de réponse au stress
extracytoplasmique σE active plsB et inhibe dgkA; le système à deux composants BasRS active dgkA
et inhibe plsB ; la réponse stringente active dgkA et inhibe plsB. Ces résultats montrent que le locus
plsB-dgkA est finement régulé par toute une série de régulateurs qui intègrent des signaux de stress
multiples afin de contrôler l’activité de la voie de biosynthèse des phospholipides.
Summary
Phospholipids are the building blocks of the bacterial plasmic membrane. The composition of the
membrane is continuously controlled by environment conditions, in order to adapt its fluidity and
maintain the homeostasis. The enzymatic steps of the phospholipid synthesis pathway in the inner
membrane of E. coli are well known. However, little is known about the supramolecular organization
and the genetic regulation of the enzymes catalyzing these reactions, these questions constituting the
two main axes developed in this thesis.
Two-hybrid studies have evidenced a network of protein-protein interactions, suggesting the existence
of a membrane protein complex formed by phospholipid synthesis enzymes. To test this hypothesis, I
wanted to assay these interactions in native conditions, by using techniques such as FRET, BRET or
Tandem Affinity Purification. Toward this goal, I have developed novel cassettes permitting to
systematically construct E. coli strains that produce proteins tagged with fluorescent or affinity tags,
under physiological expression. This allowed me to study the localization and stœchiometry of
phospholipid synthesis enzymes in the membrane.
Furthermore, I have studied the regulation in response to stress of the plsB gene that codes for the first
enzyme of the phospholipid synthesis pathway, and of dgkA that codes for a diacylglycerol kinase that
recycles phospholipids. These two neighboring and divergent genes are inversely regulated in response
to three stress responses: the extracellular stress σE factor activates plsB and inhibits dgkA; the two-
component system BasRS activates dgkA and inhibits plsB; stringent response activates dgkA and
inhibits plsB. These results show that the plsB-dgkA locus is regulated by a series of regulators that
integrate multiple stress signals, in order to control the activity of the phospholipids synthesis pathway.
Mots clés : phospholipides, interactions protéine-protéine, métabolisme des lipides, réponse au
stress, RpoE, BasRS, Escherichia coli.
Discipline : Microbiologie Moléculaire
Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Macromoléculaires
CNRS UPR9027, 31 Chemin Joseph Aigiuer, 13402 Marseille Cedex 20 Sommaire
SOMMAIRE

LISTE DES ABREVIATIONS 1

AVANT-PROPOS 3

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 5
I. LE METABOLISME DES ACIDES GRAS CHEZ E. COLI 6
A. L’acyl carrier protein, co-facteur central du métabolisme des acides gras 6
B. Le cycle de biosynthèse des acides gras 8
B1. La synthèse des acides gras saturés 8
B2. La synthèse des acides gras insaturés 9
B3. Organisation supramoléculaire des enzymes de la synthèse des acides gras 9
C. La dégradation des acides gras 10
C1. L’importation des acides gras exogènes à longue chaîne 10
C2. La β-oxydation des acides gras 11
1. La β-oxydation aérobie 12
2. La β-oxydation anaérobie 13
II. LA VOIE DE BIOSYNTHESE DES PHOSPHOLIPIDES CHEZ E. COLI 14
A. La structure des phospholipides majeurs de E. coli 14
B. La voie de biosynthèse de novo des phospholipides 14
B1. Les deux étapes d’acylation du glycérol-3-phosphate 15
1. Acylation du G3P par les voies PlsB ou PlsX/PlsY 15
2. La deuxième acylation de l’acide lysophosphatidique par PlsC 16
B2. Les modifications des têtes polaires 17
1. La voie de biosynthèse des phospholipides zwittérioniques 17
2. La voie de biosynthèse des phospholipides anioniques 18
B3. Modification des chaînes acyles dans la membrane : cyclopropanation 19
C. Dégradation et turnover des phospholipides 20
C1. Utilisation des têtes polaires des phospholipides 20
C2. Utilisation des chaînes acylées des phospholipides 21
D. Export des phospholipides vers la membrane externe 22
E. Protéines de fonction inconnue impliquées dans le métabolisme des lipides 23
E1. L’acyltransférase YihG 24
E2. La cardiolipine synthase 2 YbhO 24
E3. La kinase cytosolique YegS 24
III. ORGANISATION SUPRAMOLECULAIRE DES PROTEINES DE LA
BIOSYNTHESE DES PHOSPHOLIPIDES DANS LA MEMBRANE INTERNE 26
A. Topologie des protéines de la biosynthèse et du recyclage des phospholipides 26
B. Localisation des phospholipides et des protéines de la biosynthèse des
phospholipides 27
B1. Localisation des protéines de la biosynthèse des phospholipides 27
B2. Rôle des phospholipides dans la fonction et localisation des protéines membranaires 28
C. Interactions entre les protéines de la biosynthèse des phospholipides 30

Sommaire
IV. LA VOIE DE BIOSYNTHESE DU LIPOPOLYSACCHARIDE 32
A. La voie de biosynthèse du lipide A 32
B. L’export du LPS synthétisé de novo 33
B1. Le transporteur ABC – MsbA 33
B2. La voie Lpt 34
C. Les modifications du lipide A 34
C1. Addition de groupements polaires sur le lipide A 34
C2. Modifications des chaines acyles du lipide A 36
D. Régulation de la voie de biosynthèse du LPS 36
D1. Régulation globale des gènes de la voie de biosynthèse du LPS 36
D2. Régulations des gènes des modifications du lipide A 37
1. Rôle des TCSs PhoPQ et BasRS dans la régulation des modifications du LPS 37
2. Régulation de eptB par RpoE et MgrR 40
V. REGULATION DU METABOLISME DES LIPIDES CHEZ E. COLI 42
A. Organisation des gènes codants pour les enzymes du métabolisme des lipides 42
B. Régulation transcriptionnelle des gènes du métabolisme des lipides 43
B1. Les régulateurs du métabolisme des acides gras : FadR et FabR 43
B2. Le TCS ArcAB 44
B3. Régulation RpoE-dépendante du métab