Photoionisation et spectrométrie de masse : un nouvel outil pour l
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Photoionisation et spectrométrie de masse : un nouvel outil pour l'identification de biomolécules, Photoionisation and mass spectrometry : a novel tool for the identification of biomolecules

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Description

Sous la direction de Olivier Laprévote
Thèse soutenue le 17 octobre 2008: Evry-Val d'Essonne
Mon travail de thèse a été entièrement dévoué à l’étude d’une récente technique d’ionisation en spectrométrie de masse : la photoionisation à pression atmosphérique (APPI). Ce travail est développé sur deux axes principaux. D’une part, il vise à appliquer cette méthode d’ionisation à de nouvelles familles de molécules et d’en élargir le cas échéant le domaine d’application. D’autre part et parallèlement à cela, nous nous sommes attachés à l’étude des mécanismes de formation des ions ainsi qu’à l’élucidation des voies de fragmentation. En effet, ces dernières se révèlent souvent intensives et particulières. Les résultats obtenus dans le cadre du premier axe de recherche de ce travail de thèse offrent de nouvelles solutions pour mieux comprendre le comportement de molécules biologiques sous irradiation UV et à pression atmosphérique. En effet, nous avons pu démontrer que la photoionisation à pression atmosphérique pouvait s’étendre à d’autres classes de composés que ceux initialement pressentis et plus particulièrement à des biomolécules polaires et de haut poids moléculaire tels que les acides nucléiques, peptides, les peptides, etc. De plus, ce travail a permis de démontrer l’impact du milieu (solvant) sur le mécanisme de formation des ions sous irradiation UV. Ainsi l’étude et la connaissance des mécanismes fondamentaux de formation des ions en APPI a visé in fine au contrôle de la formation des ions précurseurs et par voie de conséquence, à celui des fragments générés en source. Nous avons observé des ions fragments radicalaires d’un type nouveau, jamais observé auparavant avec les sources d’ions connues L’originalité et le caractère résolument novateur de cette expérience nous ont amené à transférer cette expérience sur une ligne de lumière du Synchrotron SOLEIL. L’utilisation d’une source de lumière accordable en APPI va certainement renforcer la versatilité de cette source d’ions.
-Processus radicalaires
My PhD’s work has been completely dedicated to develop new ionization source in mass spectrometry: the atmospheric pressure photoionization (APPI). This work is developed on two main areas. On the one hand, it aims to apply this method to new family of biomolecules. On the other hand, we report a comprehensive study on the ionization mechanisms in APPI. The first part of this manuscript offers a better understanding of the behaviour of the biological molecules under VUV radiation and atmospheric pressure. Indeed, we were able to say that polar and high molecular weight biomolecules could be easily photoionizable. Moreover, this work allows studying the effect of the medium (solvent) on the photoionization mechanism to be studied. It is possible to control the orientation of the observed reactions and to choose a particular type of molecular ion. We observed extensive and peculiar fragmentations which have never been detected with classical ionization techniques. The originality and innovative approach of this experience led us to transfer it to a UV beamline of the Synchrotron SOLEIL. Using an accordable source will certainly enhance the versatility of the ion source.
-Radical processes
Source: http://www.theses.fr/2008EVRY0041/document

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Langue English
Poids de l'ouvrage 8 Mo

Exrait

UNIVERSITÉ D’EVRY VAL D’ESSONNE




ÉCOLE DOCTORALE :
DES GÉNOMES AUX ORGANISMES



THÈSE

Présentée



A L’INSTITUT DE CHIMIE DES SUBSTANCES NATURELLES (ICSN)


En vue de l’obtention du grade de

DOCTEUR EN SCIENCES DE L’UNIVERSITÉ D’ÉVRY VAL D’ESSONNE

par

Aïcha BAGAG



PHOTOIONISATION ET SPECTROMÉTRIE DE MASSE : UN NOUVEL
OUTIL POUR L’IDENTIFICATION DE BIOMOLÉCULES




Soutenue le 17 Octobre 2008 devant la Commission d’Examen :



Mme Florence GONNET Présidente
M. Andries BRUINS Rapporteur Laurent DEBRAUWER Rapporteur
Mme Catherine LANGE Examinateur
M. Alexandre GIULIANI
M. Olivier LAPREVOTE Directeur de thèse A Rachid,

Pour ton amour et ton soutien inconditionnel depuis toutes ces années. Pour ta capacité à
trouver les mots justes et réconfortants, pour ta patience et le bonheur que tu m’apportes
jour après jour. Pour toutes ces raisons qui font que tu es mon mari. Merci à toi pour m’avoir
supporté et resté patient même dans les moments difficiles. Ce travail n’aurait pu voir le jour
sans ton soutien et c’est pour toutes ces raisons que je tiens à te dédier ce travail de thèse.

A mes parents,

Vous avez veillé sur moi depuis ma naissance jusqu’à ce que je suis ; vous m’avez assuré une
vie digne ; vous avez manifesté beaucoup de sacrifices afin de me voir grandir devant vos
yeux. Aujourd’hui, vient mon tour pour vous remercier en vous offrant ce travail qui est le
fruit de vos sacrifices. Maman, Papa, je vous dois toute ma vie ! Cette réussite est aussi la
vôtre.

A ma sœur Fatima,

Pour tous les moments de bonheur partagés. Pour m’avoir encouragée et réconfortée dans les
moments de doute et soutenue dans mes projets professionnels et personnels. Merci grande
sœur.

A Hassan, Fayssal et Rachid,

Pour votre gentillesse et vos encouragements. Vous êtes pour moi des frères exemplaires.
Merci pour avoir réussi à supporter une sœur caractérielle. Merci.

A ma belle famille,

Ils ont toujours été présents pour moi et ce depuis le début de mon travail de thèse. Je les
remercie du fond du cœur pour leurs encouragements et leur amour.












REMERCIEMENTS


Je tiens à remercier Monsieur le Docteur Olivier LAPREVOTE, directeur de thèse,
de m’avoir accueillie dans son équipe, de ses compétences scientifiques, de son enthousiasme
quotidien, de son dynamisme pour la valorisation des résultats, et des formations et congrès
auxquels il m’a permis de participer.

Je remercie chaleureusement Monsieur le Docteur Alexandre GIULIANI,
responsable scientifique de cette thèse, pour la qualité de son encadrement et la confiance
qu’il m’a témoignée en me laissant une grande liberté d’action, valorisant ainsi ma thèse
comme un projet professionnel. Sa constante disponibilité, sa bonne humeur, son
enthousiasme, ses conseils, ses compétences scientifiques et nos enrichissantes discussions
m’ont permis de mener mes travaux dans les meilleures conditions, d’élargir mes
connaissances à l’interface physique-chimie et de me former à des techniques nouvelles.

J’adresse également mes remerciements à Madame la Docteur Florence GONNET
pour avoir accepté de présider ce jury de thèse.

Je remercie vivement Monsieur le Professeur Andries BRUINS pour l’honneur que
vous me faîtes en ayant accepté d’être rapporteur de ces travaux, pour ces discussions
enrichissantes lors des différents congrès internationaux.

Je tiens aussi à remercier Laurent DEBRAUWER d’avoir accepté d’être l’un des
rapporteurs de ce travail de thèse.

Un grand merci à Catherine LANGE pour m’avoir fait l’honneur de votre présence
au sein de mon jury de thèse, pour m’avoir initié à la spectrométrie de masse.

Je remercie également le Professeur Jean-Yves LALLEMAND pour la confiance que
vous m’avez témoigné en m’accordant ce financement qui m’a permis de mener à bien cette
thèse.

Tous mes remerciement vont également à :

Farida Benabdallah, pour tous ces bons moments partagés, nos échanges scientifiques et
personnels.

Isabelle Schmidt-Afonso, pour ton amitié, ces heures passées devant la chaîne HPLC pour
purifier ce fameux « DF8 », tous tes conseils de maman.

Vincent Guérineau, pour ta disponibilité et ta bonne humeur.
Alain Brunelle, pour toute l’expérience que tu as su m’apporter, pour ton aide dans la
compréhension de la physique des particules

Nora Tahallah, pour ton amitié, ces très bons moments partagés lors des congrès, toutes ces
discussions sur notre vision du monde.

Jean Pierre Le Caer, pour ta bonne humeur et tes précieux conseils.

David TOUBOUL, pour tous ces bons moments partagés, nos échanges scientifiques.

Delphine DEBOIS, pour ta bonne humeur au sein du bureau.

Alexandre Seyer, j’espère que le laboratoire saura t’apporter tout ce que tu recherches

Julie et Sylvie, pour votre accueil, votre disponibilité et votre bonne humeur.

Toute l’équipe DISCO, pour votre accueil lors de mes passages à SOLEIL et pour votre
disponibilité. SOMMAIRE

Introduction Générale…………………………………………………………..1


ère1 PARTIE : GENERALITES

CHAPITRE 1 : Quelques notions fondamentales………………………..…...4


I. INTERACTION LUMIERE/MATIERE………………………………………………….....4
I.1 Principaux processus d’interaction du photon…………………….………………..4
I.1.1 La diffusion Rayleigh…………………….…………………………...…..5 I.1.2 La diffusion Thomson ……………………………………….…………....5 I.1.3 L’effet Raman…………………………………………………….…….....6
I.1.4 La photoabsorption…………...………………………………….…….....6 I.1.5 Comparaison des processus…………..………………………….…….....7

II. STRUCTURE ELECTRONIQUE DES ATOMES ET DES MOLECULES…………........8
II.1 Structure des molécules…………………………………………………………....8
I.1.1 Approximation de Born-Oppenheimer……………………………………8 I.1.2 Approximation de Hartree-Fock………………………………………….9 I.1.3 Energie des orbitales…………………………………………………….10
II.2 Physicochimie d’une molécule électroniquement excitée ……………………….11
II.3 Diagramme de Jablonski…………………………………………………………14
II.3.1 Emissions radiatives……………………………………………………15 II.3.2 Processus non radiatifs…………………………………………………16

III. STABILITE ET REACTIVITE DES IONS EN PHASE GAZEUSE……………………17
III.1 La théorie de la réaction unimoléculaire en spectrométrie de masse …………...18
III.1.1 La théorie statistique RRKM/QET…………………………………..…19 III.1.2 Facteurs influençant le calcul de la constante de vitesse …………..…21
a) La géométrie de l’état de transition…………………………………..21
b) Le temps de résidence des ions……………………………………...22
III.1.3 Application de la théorie des réactions unimoléculaires à la SM……..23
a) La fenêtre d’observation…………………………………………….24
b) L’énergie interne E déposée sur l’ion……………………………….24 int
III.2 Energie interne…………………………………………………………………..26
III.2.1 L’ion précurseur ………………………………………………………26 III.2.2 L’excitation secondaire………………………………………………..27 III.2.3 Principe de la mesure d’énergie interne des ions par les thermomètres
chimiques …………………………………………………………………………………….30
III.3 Cinétique de dissociation des ions selon une distribution d’énergie interne ……35
III.3.1 A haute pression ou « rapid energy exchange limit » ………………...36 III.3.2 A basse pression ou « slow energy exchan…………………..38

Références bibliographiques I……………………………………………………………….39

ième2 PARTIE : PROCEDES EXPERIMENTAUX


CHAPITRE 2 : Spectrométrie de masse…………………………………………....44

I. LE SPECTROMETRE DE MASSE…………………………………………………….….44
I.1 Qu’est ce que la spectrométrie de masse………………………………………….44
I.2 Qu’est ce qu’un spectromètre de masse…………………………………………...45
I.3 Le spectromètre utilisé : le QStar pulsar i ………………………………………...46

II. LE DETECTEUR EQUIPANT LE SPECTROMETRE DE MASSE ……………………48

III. L’ANALYSEUR DE MASSE …………………………………………………………...49
III.1 Les analyseurs de type quadripolaire……………………………………………49
III.2 L’analyseur à temps de vol………………………………………………………52
III.2.1 Principe général ………………………………………………………52 III.2.2 Le réflectron…………………………………………………………...53 III.2.3 L’injection orthogonale………………………………………………..54

IV. L’INTERFACE…………………………………………………………………………...57
IV.1 Paramètres instrumentaux caractérisant l’interface…….……………………….57

Références bibliographiques II………………………………………………………………60

CHAPITRE 3 : La photoionisation à pression atmosphérique (APPI)……..61

I. INTRODUCTION ET BREF HISTORIQUE……………………………………………...61
I.1 Détection par photoionisation couplée à la chromatographie en phase gazeuse …61
I.2 Détection par photoionisation couplée à la chromatographie en phase liquide …..61
I.3 Les prémices de la spectrométrie de masse par photoionisation………………….62
I.4 Principe de base de ces sources : le thermospray…………………………………65
I.4.1 Relation entre la température de chauffage et la température de spray...66 I.4.2 Influence de la température dans deux systèmes de solvants…………...67 I.4.3 Influence du débit de solvants : exemple dans l’eau…………………….68
I.4.4 Influence de la tension de cône………………………………………….69 I.4.5 Influence du potentiel d’extraction……………………………………...70 I.4.6 Conclusions sur les résultats obtenus…………………………………...70

II. PROPRIETES ET MECANISMES DE L’APPI ………………………………………….72
II.1 Principe de base…………………………………………………………………..72
II.2 Photoionisation « directe »……………………………………………………….75
II.3 Photoionisation « assistée »………………………………………………………76
II.3.1 Transfert de proton……………………………………………………..77 II.3.2 Transfert de charge……………………………………………………..80
II.4 Photoionisation en mode négatif : implication des photoélectrons ……………...80
II.4.1 Recombinaisons dissociatives et mécanismes apparentés……………...83
II.5 Effet de la nature du solvant et du dopant sur les processus d’ionisation ……….84
iiIII. CHAMP D’APPLICATION DE LA PHOTOIONISATION…………………………….86
III.1 Analyse de composés pharmaceutiques ………………………………………...86
III.1.1 Les stéroïdes…………………………………………………………...86 III.1.2 Les métabolites………………………………..……………………….87
III.2 Analyse environnementale et polluants………….………………………………88
III.3 Analyse de biomolécules ………………………………………………………..89
III.3.1 Les peptides……………………………………………………………89 III.3.2 Les lipides……………………………………………………………...90 III.3.3 Les acides nucléiques…………..……………………………………...91
III.4 Autres applications………………………………………………………………91
III.4.1 Produits naturels : les flavonoïdes…………….………………………92 III.4.2 Composés dans les matrices alimentaires……………………………..92
III.4.3 Composés organiques synthétiques…………………………….……...92
III.4.4 Analyse géologique…………………………………………………….93 III.4.5 Les polymères …………………………………………………………94

IV. RECENTS DEVELOPPEMENTS DE LA SOURCE ET SES COUPLAGES..………...96
IV.1 Couplage de l’APPI à un spectromètre de type FTICR…………………………96
IV.2 Combinaison des sources à photoionisation : émergence des sources « duales »97
IV.3 La miniaturisation des sources APPI……………………………………………98
IV.4 Couplage de l’APPI avec d’autres méthodes séparatives……………………...102
IV.5 Une technique très proche de l’APPI : l’APLI ………………………………..104
IV.6 Le DAPPI………………………………………………………………………105

V. LES LIMITATIONS DE CETTE TECHNIQUE………………………………………..107

Références bibliographiques III……………………………………………………………109

CHAPITRE 4: Les sources de lumière………………………………………….…126

I. SOURCES DE RAIES : LES LAMPES A DECHARGES……………………………….126
I.1 Historique………………………………………………………………………...126
I.2 Principe de fonctionnement……………………………………………………...126
I.3 Cas des lampes de photoionisation (PID)……………………………………..…127

II. LES SOURCES ACCORDABLES : LE RAYONNEMENT SYNCHROTRON……….128
II.1 Généralités………………………………………………………………………128
II.2 L’installation du rayonnement synchrotron SOLEIL….......................................129

III. LA LIGNE DE LUMIERE DISCO……………………………………………………..132
III.1 Présentation de la ligne DISCO…………………………………………..……132
III.2 Aimant et tête de ligne ………………………………………………………...132
III.3 L’optique……………………………………………………………………….136
III.4 Le vide………………………………………………………………………….138
III.4.1 Le pompage différentiel…………………...………………………….138
III.5 Synchronisation QStar/monochromateur………………………………………140

Références bibliographiques IV……………………………………………………………142
iiième3 PARTIE : RESULTATS ET DISCUSSION

CHAPITRE 5: Etude d’acides nucléiques………………………………………...143

I. INTRODUCTION GENERALE………………………………………………………….143
I.1 Généralités sur les acides nucléiques ……………………………………………143
I.2 Propriétés physico-chimiques des bases nucléiques…………………………..…146

II. ETUDE DE BASES PURIQUES ET PYRIMIDIQUES EN APPI……………………...147
II.1 Conditions expérimentales……………………………………………………...147
II.2 Photoionisation en absence de dopant : photoionisation directe………………..148
II.3 Photoionisation en présence de dopant : photoionisation assistée……………...154
II.4 Expériences de dissociations induites par collision ……………………………156

III. ETUDE DE RIBO- ET DEOXYNUCLEOSIDES EN APPI-MS………………………160
III.1 Les ribonucléosides ……………………………………………………………160
III.2 Les déoxynucléosides …………………….……………………………………165

IV. ETUDE DE RIBO- ET DEOXYRIBONUCLEOTIDES EN APPI-MS……..…………166
IV.1 Les ribonucléotides ……………………………………………………………166
IV.2 Les déoxyribonucléotides…………………….……………..…………………170

V. CONCLUSIONS GENERALES……………………………………...…………………171

Références bibliographiques V…………………………………………………..…………172

CHAPITRE 6: Etude d’oligodéoxynucléotides..…………………...……………175

I. INTRODUCTION GENERALE……………………………………………………….…175
I.1 Fragmentation des oligonucléotides par spectrométrie de masse ………….……175
I.2 Fragmentation d’oligonucléotides en mode d’ionisation négatif …..……………176

II. ETUDE DE DI- ET TRIMERES ………………………………………......……………179
II.1 Optimisation des conditions expérimentales ……………………………...……179
II.1.1 Choix du solvant et du tampon………………………………..………179 II.1.2 Optimisation des paramètres de la source……………………………180
II.2 Etude de nucléotides en mode d’ionisation positif ……………………..………180
II.2.1 Cas d’un dinucléotide d(TA)……………………………..……………181 II.2.2 Cas d’un trinucléotide d(TAG)……………………………..…………185
II.3 Etude de nucléotides en mode d’ionisation négatif ……………………….……186
II.2.1 Cas du dinucléotide d(TA)……………………………………..……...186 II.2.2 Cas du trinucléotide d(TAG)…………………………..………………188

III. DISCUSSION DES RESULTATS OBTENUS & CONCLUSION………...…..………189

Références bibliographiques VI……………………………………………………………195
ivCHAPITRE 7: Etude d’oligosaccharides.………...………………………………201

I. INTRODUCTION GENERALE………………………………………………….………201

II. NOMENCLATURE ET OBSERVATION DES FRAGMENTS……………..…………202

III. ETUDE D’OLIGOSACCHARIDES NATIFS…………………………………….……206
III.1 Etude d’un sucre simple : le glucose…………………………………...………206
III.1.1 Conditions expérimentales…………………………………...………207 III.1.2 Photoionisation du glucose en mode positif dans le système de solvant
H O/MeOH (50 :50, v/v)……………………………………………………………….……207 2
III.1.3 Photoionisation du glucose en mode positif dans le chloroforme ...…210 III.1.4 Photoionisation du glucose en mode négatif…………………………211
III.2 Etude de quelques disaccharides natifs…………………………………...……212
III.2.1 Photoionisation dans le système H O/MeOH (50 :50, v/v)………..…212 2III.2.2 Photoionisation des disaccharides dans le chloroforme…………..…217
III.3 Etude de deux trisaccharides…………………...………………………………221

IV. ETUDE D’OLIGOSACCHARIDES PERMETHYLES……………………..…………225
IV.1 Etude du glucose perméthylé…………………………………………..………225
IV.2 Etude de disaccharides perméthylés………………………………………...…230
IV.2.1 Etude dans le système H O/MeOH (50 :50, v/v)………..……………230 2IV.2.2 Etude dans le chloroforme………………………………..…………..233
IV.3 Etude de trisaccharides perméthylés……………………………...……………236
IV.3.1 Etude du cellotriose (III’ )……………………………………………236 βIV.3.2 Etude du raffinose (III’ )………………………..……………………238 α

V. CONCLUSIONS………………..………..………………………………………………239

Références bibliographiques VII…………………………………………...………………241

CHAPITRE 8: Etude de peptides.……………………………………………….…244

I. INTRODUCTION GENERALE……………………………………………….…………244
I.1 Nomenclature de fragmentation des peptides …………………………………...244
I.1.1 Nomenclature pour le mode positif………………………….…………244 I.1.2 Etude de peptides en mode d’ionisation négatif……….………………247
I.2 Brève revue de la littérature des mécanismes observés en ECD..………….........249
I.2.1 Principe de base de l’ECD…………………………………………..…250I.2.2 Mécanismes proposés………………………………………………..…250
I.3 Rappel des travaux antérieurs obtenus en photoionisation ……………...………253
I.4 Objectif de l’étude…………………………………………………..……………255

II. ETUDE DU PEPTIDE NATIF ……………………………………………….…………255
II.1 Conditions expérimentales…………………………...…………………………255
II.1.1 Peptide étudié………………………………………....………………255 II.1.2 Optimisation des paramètres de la source……………………..……..260
v II.2 Comparaison du mode positif et mode négatif…………………………….……261
II.3 Spectres MS/MS de DF8 dans iPrOH………………………………………..…265
II.4 Spécificité de formation des ions de type c………………………….…………266

III. ETUDE DU PEPTIDE DANS DES CONDITIONS ACIDES.…...……………………268
III.1 Comparaison avec le peptide natif (i.e en solution non acidifiée)………..……268
III.2 Etude des massifs isotopiques des ions de séquence c…………………………270
III.3 Origine des ions c en présence d’acide………………………...………………272

IV. CONCLUSION..……………………………………………..……….…………………273

Références bibliographiques VIII………….………………………………………………275


ème4 PARTIE : PERSPECTIVES


CHAPITRE 9: Dégâts des radiations ionisantes.……………..…………………280

I. INTRODUCTION GENERALE………………………………………………………….280
I.1 Importance des dégâts des radiations sur les systèmes vivants….………………280
I.1.1 Toxicité des radiations ionisantes…………………………...…………281
I.2 Classification des dommages……………………………………………….……281
I.3 Les objectifs de ce travail……….……………………………….………………283
I.3.1 Photoionisation à 10 eV sur un nébulisat et étude de l’effet du milieu sur
la dégradation des oligonucléotides………………………………………………...………283 I.3.2 Procédés expérimentaux mis en œuvre - Etude des oligonucléotides….284

II. RESULTATS…………………………………………………………………………….285
II.1 Photoionisation dans l’eau en présence d’acétone (1 à 4 %)…………………....286
II.2 Photoionisation dans l’eau en présence d’acétone deutérée (1 à 4 %)………….288
II.3 Photoionisation dans D O en présence d’acétone………………………………288 2

III. DISCUSSION……………………………………………...……………………………290
III.1 Mécanismes des dommages indirects sur les nucléotides….…………..………290
III.2 Et les dommages sur les protéines ?………………………………...………….292

Références bibliographiques IX……………………………………………………………293


Conclusions Générales……………………...………………………………296

Figures………………………………………………………………………………….298

Tableaux………………………………………………………………………………310
vi

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