Proteolytic activation of human influenza viruses [Elektronische Ressource] / Stephanie Bertram

Stephanie Bertram

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• Biologie
• Gesundheit

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 47
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

Proteolytic Activation of human Influenza Viruses



Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades



DOKTORIN DER NATURWISSENSCHAFTEN
Dr. rer. nat.


genehmigte Dissertation
von
Diplom-Biologin Stephanie Bertram
geboren am 10. Juni 1983 in Wolfenbüttel





2011 Referent: Prof. Dr. Stefan Pöhlmann
Koreferent: Prof. Dr. Thomas Pietschmann
Tag der Promotion: 4. Mai 2011



Index 1
Index

1. Abstract……………………………………………………………………………………..3

2. Zusammenfassung………………………………………………….……………….5

3. Introduction………………………………………………………………………………...7
3.1 Epidemiology of influenza viruses……………………………………………….8
3.2 Treatment and prevention of influenza…………………...……………………12
3.3 Biology of influenza viruses……………………………………………………..14
3.3.1 Aetiology and classification…………………………………………….14
3.3.2 Viral particle…………………………………………………………….15
3.3.3 Genome structure………………………………………………………..17
3.3.4 Replication cycle………………………………………………………..17
3.3.5 Viral entry……………………………………………………………….20
3.3.6 Proteolytic activation of hemagglutinin………………………………...24
Role of hemagglutinin cleavage in pathogenicity…………………..24
Different host cell proteases are involved in the cleavage
of influenza viruses………………………………………………….25
Subtilisin-like proteases………………………………………27
Extracellular and endosomal trypsin-like proteases………….27
Proteolytic activation of HA mediated by NA…………...…29
Type II transmembrane serine proteases (TTSPs)……………30

4. Aim of the study…………………………………………………………………………..34

5. Manuscripts……………………………………………………………………………….35
Stage of publication………………………………………………………………..35
First manuscript…………………………………………………………………...36
Second manuscript………………………………………………………………...48

6. Discussion………………………………………………………………………………….58
6.1 First manuscript: Proteolytic activation of the 1918 influenza
virus hemagglutinin……………...…………………………………………………..58 Index 2
6.2 Second manuscript: TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate
trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells…………………...62

7. List of references………………………………………………………………………….66

8. Appendix…………………………………………………………………………………..86
List of abbreviations…………………………………………………………………86
Acknowledgements…………………………………………………………………..88
Curriculum Vitae……………………………………………………………………89
List of puplications…………………………………………………………………..90
Declaration (Erklärung)……………………………………………………….…….93



1. Abstract 3
1. Abstract

The influenza virus hemagglutinin (HA) mediates viral entry into target cells. Newly
synthesized HA is inactive and requires cleavage by host cell proteases to transit into an
active form. Activation is indispensable for viral infectivity and the responsible proteases are
targets for antiviral intervention. However, the identity of the HA-activating proteases is
incompletely defined. Highly pathogenic avian influenza viruses are activated by ubiquitously
expressed subtilisin-like proteases. In contrast, the proteases responsible for activation of
human influenza viruses and low pathogenic avian influenza viruses are largely unknown, and
type II transmembrane serine proteases (TTSPs) have recently been suggested as candidates.
Interestingly, the highly pathogenic 1918 influenza virus, the causative agent of the Spanish
influenza, and the closely related virus A/WSN/33 seems to have evolved special mechanisms
to ensure HA activation: Both viruses employ their neuraminidase (NA) protein to ensure HA
cleavage. The A/WSN/33 NA accomplishes HA cleavage by recruiting the preprotease
plasminogen, while the mechanism underlying 1918 NA-driven cleavage of 1918 HA is
unknown. The goal of the present study was to examine if 1918 NA, like A/WSN/33 NA
facilitates HA cleavage by recruiting plasminogen, and to analyze the role of TTSPs in the
activation of human influenza viruses.
Binding studies revealed that A/WSN/33 NA but not 1918 NA recruited plasminogen and
analysis of viral infectivity showed that A/WSN/33 NA was unable to functionally replace
1918 NA. Thus, 1918 NA and A/WSN/33 NA evolved different mechanisms to facilitate HA
activation. In addition, evidence was obtained that 1918 NA-dependent activation of 1918 HA
is a cell line-dependent phenomenon, casting doubts on the relevance of this process for viral
spread in the host. The analysis of the NA-independent activation of 1918 HA showed that
TMPRSS2, a TTSP previously found to activate human influenza viruses, also activated the
1918 HA and the related protein TMPRSS4 was newly identified as an HA-activating
protease. The activation of HA by TTSPs was observed in transfected cells, raising the
question whether endogenously expressed TTSPs also activate HA. Expression of TMPRSS2
and TMPRSS4 was detected in the Caco-2 cell line and siRNA knock-down revealed that
these proteases facilitated viral spread in Caco-2 cells in the absence of an exogenously added
HA-activating protease. Finally, TMPRSS2 and α-2,6-linked sialic acid, the major receptor
determinant for human influenza viruses, were found to be coexpressed on type II
pneumocytes, major viral target cells. These results indicate that TMPRSS2 could support
viral spread in the infected host and constitutes an attractive target for antiviral intervention. 1. Abstract 4
Keywords:
Influenza virus, hemagglutinin, typ II transmembrane serine proteases 2. Zusammenfassung 5
2. Zusammenfassung

Das Hämagglutinin (HA) von Influenza Viren vermittelt den viralen Eintritt in Zielzellen. Es
wird als inaktive Form synthetisiert und durch Wirtszellproteasen in die aktive Form
überführt. Die proteolytische Aktivierung von HA ist für die Infektiosität unverzichtbar,
jedoch sind die HA-aktivierenden Proteasen nur teilweise bekannt. Hoch pathogene aviäre
Influenza Viren werden durch Subtilisin-ähnliche Proteasen gespalten. Welche Proteasen
humane und gering pathogene aviäre Influenza Viren aktivieren ist dagegen weitgehend
unklar. Als mögliche Kandidaten-Proteasen für die Aktivierung dieser Viren wurden Typ II
Transmembran-Serinproteasen (TTSP) vorgeschlagen und die Rolle dieser Proteasen in der
Influenza Virus-Aktivierung sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Der Erreger
der Spanischen Grippe, das hoch pathogene 1918 Influenza Virus, und das verwandte Virus
A/WSN/33 scheinen einen speziellen Mechanismus zur Spaltung des HA entwickelt zu haben.
Die Neuraminidase- (NA) Proteine beider Viren vermitteln die Spaltung von HA. Die NA des
A/WSN/33 Virus vermittelt die Spaltung des HA durch die Bindung der Präprotease
Plasminogen. Die Rolle von Plasminogen in der NA-abhängigen Spaltung des 1918 HA ist
dagegen unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit geklärt werden.
Bindungsstudien zeigten, dass die A/WSN/33 NA jedoch nicht die 1918 NA Plasminogen
bindet. Eine Analyse der Infektiosität demonstrierte, dass die A/WSN/33 NA nicht die
Funktion der 1918 NA ersetzen kann. Es ist daher wahrscheinlich, dass das 1918 Influenza
Virus und A/WSN/33 Virus unterschiedliche Mechanismen zur NA-abhängigen HA-
Aktivierung entwickelt haben. Zusätzlich wurden Hinweise erbracht, dass die 1918 NA-
abhängige Aktivierung des 1918 HA Zelllinien-abhängig ist. Die Relevanz dieses Prozesses
für die Virusvermehrung im Wirt ist daher unklar. Die Analyse der NA-unabhängigen
Aktivierung des 1918 HA zeigte, dass die Serinprotease TMPRSS2 und TMPRSS4 das 1918
HA in transfizierten Zellen aktivieren. Die Analyse der mRNA- und Protein-Expression von
TMPRSS2 und TMPRSS4 zeigte, dass beide Proteasen in der Zelllinie Caco-2 exprimiert
werden und siRNA knock-down Experimente demonstrierten, dass beide Proteasen die
Virusvermehrung in diesen Zellen in der Abwesenheit einer exogen zugegebenen HA-
aktivierenden Protease ermöglichen. Schließlich konnte die Koexpression von TMPRSS2 und
α-2,6-verknüpfter Sialinsäuren, einer wichtigen Rezeptordeterminante humaner Influenza
Viren, in Typ II Pneumozyten, wichtigen viralen Zielzellen, nachgewiesen werden. Diese
Ergebnisse zeigen, dass TMPRSS2 die Virusvermehrung im infizierten Wirt fördern könnte
und somit ein attraktives Ziel für die antivirale Intervention darstellt.

2. Zusammenfassung 6