Proteome analysis of the differential adaptation of Pseudomonas aeruginosa morphotypes isolated from cystic fibrosis patients, to iron limiting conditions, oxidative stress and anaerobic conditions [Elektronische Ressource] / von Senthil Selvan Saravanamuthu

Senthil K. Kaliappan

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• Gesundheit

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2004
• Nombre de lectures: 10
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 7 Mo

Extrait

Proteome analysis of the differential adaptation of
Pseudomonas aeruginosa morphotypes isolated from
Cystic Fibrosis patients, to iron limiting conditions,
oxidative stress and anaerobic conditions






Von dem Fachbereich Biologie der Universität Hannover

zur Erlangung des Grades

DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN
Dr. rer.nat.



genehmigte Dissertation
von







Master of Science, Senthil Selvan Saravanamuthu

geboren am 28. April 1977 in Chennai, India



Hannover
2004



Referent: Prof. Dr. D. Bitter-Suermann
Koreferrent: PD Dr. I. Steinmetz



Tag Der Promotion: 04 May 2004



Prüfungskollegium:

Vorsitz: Prof. Dr. G. Auling

Prüfende: Prof. Dr. D. Bitter-Suermann
Prof. Dr. K. Kloppstech
PD Dr. I. Steinmetz
























Abstract
The occurrence of diverse colony morphotypes of Pseudomonas aeruginosa is a
common finding in the chronically infected cystic fibrosis (CF) lung. A previous study
from our laboratory showed that the isolation of P. aeruginosa Small Colony Variants
(SCVs) could be correlated with parameters revealing poor lung function and the use of
inhalative antibiotics. Among the heterogenous group of clinical SCVs, recently a
subgroup of hyperpiliated SCVs that exhibited autoaggregative growth behaviour and
enhanced ability to form biofilms was identified. Role of these variants in the
pathogenesis is poorly understood.

In this study we compared the ability of these SCVs to survive harsh conditions like
iron limitation and hydrogen peroxide induced oxidative stress compared to their
corresponding wild types. The autoaggregative SCV 20265 showed better growth and
survival under iron limiting and oxidative stress conditions compared to the clonal wild
type. In agreement with these functional characteristics extensive comparative proteome
analysis of SCV 20265 was indicative of a better adaptation to oxidative stress and iron
limitation as compared to the corresponding wildtype, WT 20265. Proteome profile of
SCV 20265 showed differential expression of some oxidative stress combat proteins
like peroxidases, superoxide dismutases and iron acquisition related proteins like FeoB,
HasAp, FpvA.

Since occurrence of anaerobic biofilms in the CF lung is known, differential adaptation
of SCV and WT 20265 to anaerobic mode of growth using nitrate was tested. Results
indicate that SCV 20265 grows better than the WT 20265 under this condition.
Proteome analysis of anaerobically grown cells revealed the differential regulation of
some key genes involved in the anaerobic mode of growth using nitrate.

Membrane and supernatant sub proteomes of morphotypes of strain 20265 were
subjected to a gel-less proteome analysis using nanoflow LC/MS to obtain an overview
of the expression differences and pick up candidates for more detailed analysis.
Accordingly, expression of a putative ferrous iron transporter (PA 4358) was further
monitored using real time PCR analysis and its differential expression confirmed at a
transcription level too. As an interesting offshoot from the main study, polyadenylation
of mRNAs of Pseudomonas aeruginosa has been reported in this study for the first
time. DNA microarray analysis of log phase RNA preparation of strain PAO1 has
revealed that up to 42% of the expressed mRNA was polyadenylated.

Taken together our data suggest that some SCVs like the SCV 20265, represent clonal
variants which are especially adapted to oxidative stress and iron limitation, conditions
which are likely to be encountered in the CF lung. It is speculated that polyadenylation of a
significant number of expressed mRNAs might have some significance in the post-
transcriptional modification and mRNA stability.

Key words: Small colony variant (SCV), Cystic fibrosis, Pseudomonas aeruginosa,
iron, proteome analysis, H O , Polyadenylation 2 2


Kurzfassung
Das Auftreten verschiedener Kolonie-Morphotypen von Pseudomonas aeruginosa ist ein
häufiger Befund bei der chronisch infizierten Lunge von Patienten mit Cystischer
Fibrose(CF). Frühere Untersuchungen unseres Labors haben gezeigt, dass das Vorkommen
so genannter „P. aeruginosa Small Colony Variants“ (SCVs) mit schlechter
Lungenfunktion und inhalativer Antibiotikatherapie korreliert. Aus dieser heterogenen
Gruppe klinischer SCVs wurde unlängst eine Untergruppe hyperpilierter SCVs
identifiziert, die ein autoaggregatives Wachstumsverhalten und eine erhöhte Fähigkeit zur
Biofilm-Bildung aufwiesen. Über die Rolle dieser Varianten in der Pathogenese ist nur
wenig bekannt.

In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen verschiedener Faktoren, wie Eisen-Mangel und
durch Wasserstoffperoxid ausgelöster oxidativer Stress, auf das Überleben der SCVs mit
denen der entsprechenden Wildtypen verglichen. Die autoaggregative SCV 20265 zeigte
ein besseres Wachstum und Überleben unter diesen Bedingungen im Vergleich zum
klonalen Wildtyp. Diese funktionellen Charakteristikan wurden durch umfangreiche
Proteom-Analysen der SCV 20265 unterstützt, die ebenfalls auf eine bessere Anpassung
der SCV an oxidativen Stress und Eisen-Mangel im Vergleich zum entsprechenden
Wildtyp deuten. Das Proteom-Profil der SCV 20265 zeigte eine unterschiedliche
Expression einiger Schutzproteine gegen oxidativen Stress, wie Peroxidasen und
Superoxid-Dismutase und einiger Proteine, die bei der Eisen-Aufnahme eine Rolle spielen,
wie FeoB und HasAp.

Da bekannt ist, dass anaerobe Biofilme in der CF-Lunge auftreten, wurde die
unterschiedliche Anpassung von SCV und WT 20265 an anaerobe
Wachstumsbedingungen in gegenwart von Nitrat untersucht. Die Ergebnisse weisen darauf
hin, dass die SCV 20265 besser als der WT 20265 unter diesen Bedingungen wächst.
Proteom-Analysen von unter anaeroben Bedingungen gewachsenen Zellen zeigten eine
unterschiedliche Regulation einiger Schlüsselgene, die bei der Nitrat-Nutzung unter
anaeroben Wachstumsbedingungen involviert sind.

Membranen und sezernierte proteinen von Morphotypen des Stammes 20265 wurden
mittels eines Gel-unabhängigen Proteom-Analyse Verfahrens namens Nanoflow LC/MS
untersucht, um eine Übersicht über Expressionsunterschiede zu erhalten und um mögliche
Kandidaten für eine ausführlichere Analyse zu finden. Folglich wurde die Expression eines
2+vermeintlichen Fe -Eisen-Transporters (PA 4358) mittels RT-PCR genauer untersucht,
wodurch seine unterschiedliche Expression auch auf Transkriptionsebene bestätigt werden
konnte. Als interessantes „Nebenprodukt“ dieser Studie wurde eine Polyadenylierung der
mRNA in Pseudomonas aeruginosa gezeigt. DNA-Mikroarray Analysen von isolierter
RNA aus der exponentiellen Wachstumsphase des sequenzierten Stammes PAO1 haben
gezeigt, dass bis zu 42% der exprimierten mRNA polyadenyliert war.

Letztlich deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass einige SCVs, wie die SCV 20265,
klonale Varianten bilden, die besonders gut an oxidativen Stress und Eisen-Mangel
angepasst sind; eben solchen Bedingungen, wie sie in der CF-Lunge vorherrschen.
Polyadenylierung des grössten Teils der mRNA könnte eine entscheidende Rolle bei
posttranskriptionalen Modifikationen und bei der Stabilität der mRNA haben.

Schlagworte: Small Colony Variants (SCV), Cystische Fibrose, Pseudomonas aeruginosa,
Eisen, Proteom-Analyse, H O , Polyadenylierung 2 2
Acknowledgements

I owe my foremost thanks to Dr. Ivo Steinmetz for his mentorship and the opportunity to explore the
fascinating world of Pseudomonas aeruginosa. I also thank him particularly for the freedom and
encouragement he provided during the course of my PhD. I thank Dr. Susanne Haussler, pioneer of
Pseudomonas SCV research for her critical suggestions and expert guidance.

I thank Prof. Burkhard Tümmler for his valuable suggestions and periodic reviewing of the project in
his capacity as the chairperson of the EGK.

Prof. Dieter Bitter-Suermann for reviewing of this dissertation and his staunch support at all the
stages of my PhD.

My sincerest thanks are due to Prof. Jürgen Wehland, Dr. Uwe Kärst and Dr. Lothar Jansch but for
whom this work wouldn’t have been possible at all. Their consent to accommodate me at the
Proteome work group of the GBF and the relentless support rendered during my stay at GBF is
gratefully acknowledged.

I thank Prof. Brakhage and Prof. Muller for having arranged the ‘Kenntnis prufung’ without undue
delay. I thank Ms. Helga Riehn-Kopp for her valuable support as the secretary of the EGK.

My special thanks are due to Dr. Dirk Wehmhöner who has been my guru in proteomics and mass
spectrometry. I thank Ms. Kirsten Minkhart for her relentless support and technical assistance with
the LC/MS.I thank Ms.Tanja Töpfer for her excellent assis