Quantitative Analyse von T-Zell-Stimulation und Costimulation durch zelluläre Mikrosysteme [Elektronische Ressource] = Quantitative analysis of T cell stimulation and costimulation using cellular microsystems / vorgelegt von Karsten Köhler

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• Publié par: eberhard_karls_universitat_tubingen
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 34
• Langue: Deutsch
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Extrait

Quantitative Analyse von T-Zell Stimulation
und Costimulation durch zelluläre
Mikrosysteme
Quantitative Analysis of T Cell Stimulation and Costimulation
using Cellular Microsystems
DISSERTATION
Der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-Universität
Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der
Naturwissenschaften
2006
vorgelegt von
Karsten Köhler
ITag de r m ündlichen Prüfung : 3. A ugust 2006
Dekan: Prof. D r. Stefan Laufer

1. Berichterstatter: Prof. D r. Hans-Georg Ra mmensee
2. Berichterstatter: PD Dr. Rol and Broc k
IIDie vorl iegende Arbeit w urde unt er Be treuung von H errn P rof. D r. Hans-Georg Ra mmensee
unter Co-Be treuung und A nleitung von H errn P D Dr. Rol and Broc k a m Int erfakultären
Ins titut für Z ellbiologie de r U niversität Tübingen i n de r Z eit von S eptember 2002 bi s April
2006 durc hgeführt. Ihne n be iden da nke ich s ehr he rzlich für da s fort gesetzte Int eresse an
meiner Arbeit, exzellenten A rbeitsbedingungen und A rbeitsatmosphäre sowie da s m ir
entgegengebrachte V ertrauen.
IIIDanksagungen
H erzlich be danken m öchte ich m ich be i allen K ollegen a us de n G ruppen von P D Dr. R. Broc k
und P rof. D r. G. J ung.
Be i m einen Laborkollegen D r. T homas André, Yi-Da Chung, F alk D uchardt, Dr. Martin E lbs,
Nadja Fischer, Dr. Ra iner Fischer, Alexander G anser, Antje Hoff, H ans-Jörg H ufnagel,
Wilfred H ummel, Dr. Oliver Mader, Dr. Mariola Fotin-Mleczek, Günter Rot h, Ivo Rut tekolk,
Michael Sinzinger, Oda Stoevesandt, Dr. Söhnke V oss, Susanne V ollmer und S usann W olf
möchte ich m ich für di e jederzeit angenehme und he itere Atmosphäre am Arbeitsplatz
danken.
H ierbei m öchte ich T homas André für s eine Einführung i n de n Nanospotter, und für s eine
große Hilfsbereitschaft ni cht nur i n Com puter-Fragen da nken. Antje Hoff da nke ich für i hre
Einführung i n di e Zellkultur und i n di e zellbasierten E xperimente sowie in di e Laserscanning-
Mikroskopie. Ra iner Fischer da nke ich für s eine Einführung i n di e Peptidchemie und
-analytik.
Be i Günter Rot h, Prof. D r. Karl-Heinz W iesmüller und P rof. D ieter Kern für di e
Zusammenarbeit in de m interessanten Projekt zur S timulation von Z ellen m it
mikrostrukturierten O berflächen.
Dr. Be rnd M öhrle, J an Jaehrling, Nina Schweizer und P rof. D r. G. Gauglitz da nke ich für di e
spannende und e rfolgreiche Kooperation i m Bereich de r z ellulären Ri fS.
Dr. Ludger G rosse-Hovest, P rof. D r. Gundram Jung, für di e immer w ieder a nregende
Kooperation z ur U ntersuchung de r Effekte stimulatorischer Antikörper
Dr. Anne-Marie Lellouch, Dr. Hans Rogl und P rof. D r. Be rnard M alissen vom CNRS-
INSERM für di e erfolgreiche Kooperation und di e Generierung de r G FP-T-Zell-Linien, sowie
der Be reitstellung on A ntikörpern. A usserdem da nke ich Prof. D r. Ca rl Figdor, D r. Chri stian
Freund, D r. Be n Joosten, PD Dr. Re iner Lammers, Dr. Patrick Pankert und D r. Aukje
Zimmerman, für A ntikörper. Dr. Claus Belka für Z ell-Linien und P rof. D r. Stefan Laufer für
chemische Inhi bitoren
Ic h be danke m ich be i Nicole Sessler für P eptidsynthesen, Dr. T obias Seyberth für H ilfe be i
der H PLC und P rof. D r. Stefan S tevanović be danke ich m ich für di e Möglichkeit zur
Durchführung von M ALDI-TO F Messungen
Stefan W elte da nke ich für s eine immer w ieder in A nspruch ge nommene Hilfsbereitschaft.
Ursula Becker-S anzenbacher, Lisa Neumann und H eiderose Neu m öchte ich für i hre
Unterstützung i n S achen de r O rganisation und V erwaltung da nken.
Regina Bohne rt da nke ich für di e profe ssionelle Programmierung von M akros für di e
Bi ldanalyse.
Den Praktikanten H enrik G rabner, Laura Zöllner, Jan Niederländer, Anja Schindler für i hre
H ilfe be i de r Etablierung de r z ellulären S timulationsprotokolle.
Franziska Löwenstein da nke für da s Spülen und A utoklavieren von s ehr vi eler von m ir
benutzter G efäße und G eorg T iedemann für da s Bri ngen von vi elen Paketen.
Be danken m öchte ich m ich be i Prof. D r. H.-G. Ra mmensee für s eine Betreuung de r
Doktorarbeit, sowie de r Leitung de s Graduiertenkolleg 794 „Zelluläre Mechanismen
Im munassoziierter Prozesse“, und de n K oordinatorinnen V alerie Bahr, Re gine Grund und D r.
Be ttina W eiss für di e langjährige U nterstützung.
IVAdrian S chröder, Chri stan S pieth, Jochen S upper, Prof. D r. Z ell da nke ich für di e anregende
Kooperation i m Bereich de r Bi oinformatik.
Für di e Benutzung de r Mikroarray-S canner be danken w ir uns be i Georg O tto (MPI Tübingen)
und M ichael Hartmann (N MI Tübingen)
Für di e Finanzierung de r Projekte im Namen di eser Arbeit be danken w ir uns sehr be i de r
Volkswagen-S tiftung (I/ 77472). D er Deutschen G esellschaft für S ignaltransduktion (S TS)
and de r Europäischen K ommission da nke ich für Re isestipendien.
Ausserdem be danke ich m ich be i de nen, be i de nen i ch ve rgessen ha be, mich z u be danken.
V0.P reface an d contents of th is th esis 1
1.Introduction 5
1.1T CR-proxi mal signalling c omponents 5
1.2Adapter prot eins in T cell activation 7
1.3 Negative re gulation of t he early s teps in T CR s ignalling 10
1.4 L ipid- and c alcium-associated s ignals in T cell signalling 12
1.5 Cyt oskeletal effects and G prot eins 14
1.6 Cos timuli 15
1.7 Transcription fa ctors in T cell signalling 16
1.8 The immunological synapse 17
1.9 Chemical bi ology 18
1.10 Cellular m icroarrays 19
2.C ontributions to oth er projects 20
3.C hemical ge netics when timing is critical: A pharmacological concept for th e
maturation of T c ell contacts 21
3.1 Summary 21
3.2 Introduction 22
3.3 Re sults 23
3.3.1 F unctional integrity of fus ion prot eins 24
3.3.2 Transient re cruitment of Z AP-70-YFP to CD 3 clusters 24
3.3.3 ZAP-70-YFP colocalizes w ith CD 3 re ceptor c omplexes 26
3.3.4 Cont inuous Src-fa mily ki nase activity i s re quired for
maintenance of c ell contacts onl y i n t he early pha se of c ell
attachment 29
3.3.5 Cell de tachment is actin i ndependent 32
3.3.6 Cell re traction upon S rc-fa mily ki nase inhibition oc curs by
detachment of c ontacts 33
3.4 Discussion 35
3.4.1 Signalling c luster m aturation on a nti-CD3-coated s urfaces 35
3.4.2 M olecular m echanism of c ontact m aturation a nd de tachment37
3.4.3 A nalyis of T cell contacts by c hemical ge netics 37
4. Functional Profiling of C hemical Inhibitors an d Th erapeutic Antibodies using
Cellular M icroarrays 40
4.1 Summary 40
4.2 Introduction 41
4.3 Results 42
VI4.3.1 Implementation of c ellular m icroarrays 42
4.3.2 A ttachment of c ells to t he m icroarrays 45
4.3.3 E ffects of s mall m olecule inhibitors 48
4.3.4 F unctional characterization of a supraagonistic anti-CD28
antibody 52
4.3.5 A nalysis of prot ein c lustering by c onfocal microscopy 56
4.3.6 Q uantification of prot ein c lustering 58
4.4. D iscussion 60
4.4.1 Inhibitor e ffects on c ell spreading a nd N FAT translocation 61
4.4.2 F unctional profi ling of a supraagonistic antibody 64
5. C ell stimulation using mi crostructured surfaces 66
5.1 Int roduction 66
5.2 Re sults and D iscussion 66
5.2.1 A ctin c ytoskeletal re arrangements 67
5.2.2 A nalysis of i nfluences of l ocal stimulation on l ocal and
global prot ein phos phorylation 67

5.3.1 Effects of s timulus size on phos photyrosine clustering 71
6. Lab el-fr ee Characterisation of C ell Adhesion using R eflectometric
Interference Spectroscopy (R IfS) 74
6.