Quantitative modeling of synthetic gene transfer [Elektronische Ressource] / Simon Youssef. Betreuer: Joachim Rädler

Simon Youssef

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2011
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Extrait

Quantitative modeling of synthetic gene
transfer
Simon Youssef
M¨unchen 2011Quantitative modeling of synthetic gene
transfer
Simon Youssef
Dissertation
an der Fakult¨at fur¨ Physik
der Ludwig–Maximilians–Universit¨at
M¨unchen
vorgelegt von
Simon Youssef
aus Wur¨ zburg
Munc¨ hen, den 3.M¨arz 2011Erstgutachter: Prof. Dr. Joachim R¨adler
Zweitgutachter: Prof. Dr. Friedrich Simmel
Tag der mundlic¨ hen Prufung:¨ 10.Mai 2011.Con.tendelingtsClassication1.Zusammenfassung.7t26.5Summary.9lapseI.InmtroEvduction.11en3hingMotiv.ation.11in4expressionOv.erviewof155I.I.Methotds.17.5ofComputational.Moetdeling.approac35hes.17.5.1.Mathematical37vs.ransfercomputationalsinglemo.delsexpressio...7.3.....Assi.t.....29.t.Ev..17.5.2.A32PrimerHandlionAnalysisthe.Gillespie.algorithmdistinction.een.......Discussion...............Gene.Gene.7.118y5.3ellPi-Calculus.allo7.2wsstatean.un.b.ounded.ntheum.b.e.r.ofLinearspgneciesenandProblemreac-.tions........6.3.en.Managemen.and.en.Detection.............6.4.and.ng.Image.Ev.ts.....33.Automatic.b.w.touc.cells......23.I.I6.6I.Results.25.6.Con.text-sensitiv.e.image.ana.lysis.of.single-cell.assa.y.mo.v7iesExpression25non-viral6.1TImage39AnalysisTimeWmicroscopork-oandwc.EGFP.....41.Mo.steady.gene.n.............43.Analyzing.Distribution.Proteins....27.6.2.Cell.T.rac47kingas.7.4.Fitcordstomoleculexp.erimen.taltsdata.yi.elds10expressionnon-Markfactor.and.eectivDisplacemene.cargohsize......mRNA...de.........79.80.logic.Reaction.....11.6...12.......e.act.....are.tail....48.7.5DiscussionDiscussion......Strand.acid.on...for...t...DSD.....seman.............6.............of50758oly-ACo-Tmatcransfection.indicates.correlated.deliv75eryvian53to8.1pDeriving.relev.an.t.probabilities.for.plasmid.(co-)transfection76....54.8.2.A.Pi-Calculus.m.o77deltofnplasmicompu-dAco-transfectionDNA.language...Logic.up.mac.11.3.enable.rates59.986Theintime.distribution.of.ge.n11.5eofdeliv.ery.an.d.gene.expression.onset:.Exp.erimen.t.and.Sto.c.hasticokMo.deling.63.9.1.A.sto.c.hastic.mo.dels.repro.duces.the72mean,Dynamicsvgeneaxpressionr10.1ipancetailsandasskhew-.ness.of.the.exp.erimen.tal.o10.2nosedistributionsthelpfultimemodistributionsl.oly-A.degradation............65.9.2.Magnetofection:.a.f.aster.uptak.e.rate10.3i.s.resp.onsible.for.the.shift.in.sp.eed.and.eciency........11.displacemen.elemen.for.ucleic.based.tation.11.1.primer.the.Strand.t.......11.2.gates.building.autonomous69ar9.3hinesWhat84canBueredwgateseconstanlereactionarn.from.the.mo.del11.4torulesoptimizethethelanguagegene.trans-.fer.pro.cess?......87.Hierarc.y.abstract.tics.................89.Discussion......................70.9.4.Discussion..91.Outlo.93..k1oisson-artigeZusammenfassungeitNicderhtet-viraleinGenProzesstransfersystemeonhabarenenetsictensit?tszeitspurenhExpressionsrateinnerhalbgswdermathematiscletztenNu-DekbadetezuorrigiertwZeitserieneitgeneiutztenmatiscVwiesenektorenph?nomenologiscf?rderdasstoEinalsbringenderexogenehrittrdieDNAAbgabinonzeptionellEukundaryAnzahlotiscwheerarbZellenSoftenethdurcwiceinenkdieelt.undVieleHandauswStudienteninAnfangsvdiesemZustandFdasorscDiehzeigteungsgebietelcbProzessericeithstotenmit?bonerrt.TahrscransfektionsetetzienzenPlasmidkalseiteFeinerunktionKderoVAnektorzusammensetzungderund,miinKgeringeremdellAusma?,Exp?b3.0.ediererden.Einzelmolareek?lexpErtragerimennteHoderimeniaeaktorsicbhwmitmdensystTfalscrans-DiepExportprozessenLungenep-dersigmVauf,ektorensta-b.efassen.FitfunktionDennoeau,cdieherteil-sindExpressionsnivbisbreitejetztormArbeineneitenhastisc?bniedrigererheinliczeitaufgel?steDiesEinzelzellexpeiscehastiscrZusammenarbiKuhrmeneteFmitmoeukerstearykleinerotischkhemetracGenwtransfervkinaumdervarorhanden.undDieseAnzahlArbauseitDiesesbheeferkl?rtassthsitransziertercVhsionsnivmitt.BildvlerarbPlasmideeitungkexpdemerimenestimmtinetenllerungefZeitraerstudienBildvundeitungsereignisse,ComputermokdellierungwderDieresultierendenwProtein-Ex-erh?hpressions-Zeitkurvdenen.dDierZellenutzbarenwurdenausmitcGhsatzexpFP-ktenowdierendenumPlasmidenFtransziertzwundundEinzel-eseitigtezell-ZeitraerlmeNotwurdenendigkmitderBildv?hsamenerarbh?ugeitungeausgewhertet.henZuertung.diesemFluoreszenzinZwausecerimenkmitwurdeithelzelleneeininoidalesZeerhaltenllvdasserfolgeinemution?renngsals?ttigtegorithmEineusheenliefertetMaximalexpressionsnivwicdiekundeStartzeit.lt,VderungZellumrissestation?reniden-eaustiziert,einezuPZellspurenFzuordnetwundheFzugrundeliegendenehlercbhenehebtmitoErfol-derahrscZellereignissehkmelandeutet.det.wurdeDerzwAlgorithmhrittigeruscbherehandeltindieeitZJ.-T.uauswGruppeisungvderProf.erkreyannhtendellieUmrisseDerzuScZell-mitspurenWalsheinliclineeitarbeshZuorwurdednungspraroblem,Lieferungdaboneiomplexenbdenencleus,utztzwerwdiediegewicehAktivierungtetekleinen?bver-Plasmidenlagerungdemderomplex.normiertenkZeeinfaclleigenscMhaftendellalsdenKeobacosten.tetenSingularit?tenteilinZellendendieKerteilungostenExpres-indizieeausrenonsistenenDietttwereedertranskribierterEreignisseproimomplexzellonnul?renausLebMoenszyklus,bdietberden;ericunserenherimentetwweserden,?hro7derundDasmRNAMoendixdellStrang-Abl?sungsagte8ebeenfallstdieeineFzuatellenrinbzuvhe,erteilunggewindiesereinemKKSystemso-Teineransfektions-hexpGrunderimentteinermiteitreicGelbAbh?ngigkundistCywicanannuoreszierendenvitrProteinenersprackSpracorrektdvenenoraus.SimEinescalhlagen.ternatundimitvoneereinstimmImplemendestierungAbbaudesExpressionsmecMoelldellsAnn?herungwurdeDatenmitesdemdiePi-CalculusinAnsatzkenumthaltkreisewicAnk(Dis-)Assoziationsratenelt,sehrdieeinesinerlaubte,miteinehriebniceinhwict-expDarstellungoneneinhaltet.tielleStr?ngeVerdenerteilungeundZeiteveineMehrerepwurdenotenAbl?sungsspractiellareunhebhegrenztehAnzahlExpres-veitonexpZust?ndenenzuAusvdieerwoly-Aenden.eimSimtersuculationeindesusMoModellsderlierbefertedeineerimendetaillierte,EinbivZielariatebiomolekulareVscerteilungedingtderitKvo-TeausrDNAansfeesondersktions-cergebnissehehinsicenheln.tlicetrachdassderbexprimiertensind,PlasmideheundobFStrang-Abl?sungsprogrammarbovoerteilungen.k?rzlicUmformalendibeIFeitaktorenf?rzuenbelt,etuitivstMolek?leiBindungsanit?tenmmen,m?glicdiebinationendieeinerZuf?hrungsweahrscerecheinliceihkdarauolgendeneitwirdundjektoriedieerecAuswirkungenhdesAbstraktionsnivzeitlicErwhenDNAAblaufsvaufSoftdieeingesetztTf?rransfektionsezienzzubceeinussen,simwurdeniceintstodercsionsgeschastiscwindigkhesvZustandsmodendellerimendesKurvGen?btransfer?bte.er-diesemtragungswwurdeegsRolleerstellt.pDiesesAppMobdellmRNAbun-enhutzteund?bdetailliertererergangsratenhanismauswurdederdasLiter-d-atureingebaut,undzuvvonessertenEinzellmolek?lexpanerimenitenexpumtellendief?hrte.Startzeitvwerteilunghendesakku-istratautonomezuComputerreproer-duziehaen,rbeinn.eDasderMoZellendelorhandenenlNivsagteagierendie?nnen.VStrang-Abl?sungerscbhiebunggeeignetdebiorhemiscStartzeitenlogiscundScderzuGesamttezienzkbIneibVherwdessen,endungdievgutonekMagnetofektiontvsinderglic?hnlichenErgebnissemit?hrleistetnormalermanTDNAransfektioninkoorrektdervsilicoraus.ausf?hrt.WwurdeeiterhSimeinerulationenComput-kl?rtenhem?glicescheen.StrategiennaufArbumwurdedenCompilerGenliefedierheungsprozetsskhinsicderhintlicehderGescunhdazugeh?rigenwindigkbeitAlleundhenEzienzomzderuzuvgegeberbEingabessern.wEinbNachnethinteilndesmobGillespie-basiertenenulationslaufbeineescolutionstrahriebdiesesenen,blineahnet.rhierarceinhestoeauscalshastisceiterungenhenderMoStrangdellsheworgescar,DiedasswdiewurdeFumoPuerstrategierlogiscmGatesdertesteneinzelnenstoZeitspurenhastiscauszudemulieren.Modell,h2cessSummaryseNon-viralasgeneallotransferThesystemsthehaofvcyedelevyieldedolvoisson-likedaoasvfromertranscribthecorrectlylastwdtiallyeithelialcadetoinel,tolevwidely-eused.vcessectorsrst,fortodelivaeconsistenrdistribution.ybofapproexogenousexpDNAimple-toPi-calceuktialaryofotic9cealls.viorManphenomenologicalyumstandudieadsedinwhicthestoeldwrepmoortstoonwithtransfectionFecienciesyasofaandfunctionandofbvconceptuallyecob-torthecompumo-psitiontheand,erimentoTheadistributionlesseryextenAnt,theonlopsingle-moleculeapproacexpoferimenandtsnofulationvdetailed,ectorptrans-cellspoortbprohatcesses.steady-state.Hotowmaxievsioner,expressionwonsetorkofonstatetime-resolvshoedbroadsingle-cellshapexpiserimenantshasticofaeukprobabilitarywoticmathematicallygenewtransfectionhastichascollabbKuhreenofcircumstan.tial.w-probabiliThisconsideredthesisdeliviscomplexesonnimagesecondprorelecessingationofnexpoferimencomplex.talmotime-lapseexplainedstudiesedandcellscomputationallevmomeandelierndgcomplexofdeterminedthedel,resultingourproteinwexpression3.timedelcourses.theCellsawterewtransfecteduorescingwithternativGFP-encotationdingoplasmidsdevandusingsingle-celllwhictime-thelapsenon-expmoiviespwberebevecies.aluatedtheusingldedimageariateanalysis.eT-olungthisexhibitedpurpsigmoidalose,natceehallttracsaturatedkingaalgorithmAthattidenthesetiesthecelmlexpres-shapleves,theassignsratecellthetractime.ksdistributionandsteresolvyesexpressionerrorselsorwrepaortsPcelleeveenhtsindicativwofasunderlyingdevcelopproed.withTheloalgorithmsuccesstreatsytheThismappingasofdeleddetectedasshapteso-steptoccellprotracesinasorationaJ.-T.linefromargroupassignmentProf.prreyoblTheemlousingtthestepwweighthetederysupplasmiderpinositiontheofucleusnormalizedthecellwproptheertiesaseasactivcost.ofSingularitiessmallinumcosterindicateplasmidseitherthisevThisensimpletsdelintlythethecellularservlifefractioncycletransfectedwhicandhexpressionareelrepTheortednorbimageofanalysiseevplasmidsenertscouldwhicehfromaremoresolvwhiced.inTheexpsofttswasareximatelyincreased0.themoyieldalsoofpredictedusablecolortimeinserieco-transfectionserimenfromwithhigh-throughputelloexpanderimenantsproteins.balyeamenfactorofofmapprodelximatelyastewedotheandueliminatedusthehneedhforwstedioususeandabias-proneonenmandistributualonmoavieotenevunaluation.oundedTheumuorescenceerinsptensitSimyoftime-seriesmoobtainedyiefromaexpbi-verimendis-tsoncomputerstributionenofinco-transfe