Real time observation of TF function on translating ribosomes [Elektronische Ressource] / Christian Kaiser

Christian Kaiser

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 35
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München



Real time observation of TF function
on translating ribosomes






Christian Malte Kaiser

aus

Hannover



2006


Erklärung

Diese Dissertation wurde im Sinne von § 13 Abs. 3 bzw. 4 der Promotionsordnung vom
29. Januar 1998 von Herrn Professor Dr. F. Ulrich Hartl betreut.




Ehrenwörtliche Versicherung

Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfen erarbeitet.




München, am .................................................



......................................................................
Christian Kaiser







Dissertation eingereicht am 04. April 2006
1. Gutachter: Professor Dr. F. Ulrich Hartl
2. Gutachter: PD Dr. Konstanze Winklhofer
Mündliche Prüfung am 24. Mai 2006
i


DANKSAGUNG

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 2001 bis April 2006 in der
Abteilung Zelluläre Biochemie, Prof. Dr. F. Ulrich Hartl, am Max-Planck-Institut für
Biochemie, Martinsried, angefertigt.


Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. F. Ulrich Hartl für die Betreuung meiner
Promotion, für die Überlassung des interessanten Themas und die Bereitstellung
ausgezeichneter Arbeitsbedingungen. Seine stete Unterstützung und sein lebendiges
Interesse an meiner Arbeit waren die Grundlage für das Gelingen dieser Arbeit.

Frau PD Dr. Konstanze Winklhofer danke ich für die Übernahme des Co-Referats.

Bei den Mitarbeitern der Abteilung Zelluläre Biochemie bedanke ich mich für ihre
kollegiale Hilfe und eine gute Arbeitsatmosphäre. Allen voran danke ich Dr. Peter Breuer
und Hung-Chun Chang, denen ich mich auch freundschaftlich verbunden fühle.

Besonders herzlich danke ich Dr. José M. Barral für die sehr gute, fruchtbare und
außerordentlich freundschaftliche Zusammenarbeit. Durch seine fachliche Kompetenz und
seinen Enthusiasmus hat er über die gesamte Zeit meiner Promotion für Motivation und
Inspiration gesorgt und so wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.


Für Inspiration außerhalb des Labors während meiner Doktorarbeit in München bin ich
Helmut Dreschhoff und meinem langjährigen Weggefährten Marian Kalocay dankbar.

Meiner Partnerin Christiane Dreisbusch danke ich von ganzem Herzen für ihre
bedingungslose liebevolle Unterstützung, die mich durch die späteren Phasen meiner
Promotion getragen hat.

Schließlich danke ich ganz besonders meiner Familie, insbesondere meinem Bruder Philipp
Kaiser und meiner Mutter Ilse Kaiser, die nie müde wurde, mich Zeit meines Lebens zu
unterstützen. Ohne ihre Hilfe und ihren Rückhalt wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen.
iiCONTENTS


CONTENTS


I SUMMARY...........................................................................1

II INTRODUCTION...................................................................4
II.1 Protein structure and principles of protein folding in vitro.......................... 4
II.2 Protein synthesis and folding in the cell ......................................................... 8
II.3 Molecular chaperones....................................................................................10
II.4 Chaperone systems in the cytosol.................................................................. 12
II.4.1 Ribosome-associated chaperones............................................................13
II.4.2The Hsp70 system ................................................................................... 15 II.4.3 The chaperonins ...................................................................................... 17
II.4.4Additional chaperone systems................................................................. 19
II.5 Protein synthesis on the ribosome and early events in de novo protein folding.. 21
II.5.1 The ribosome...........................................................................................21
II.5.2Translation and folding ........................................................................... 24 II.5.3 Trigger factor..........................................................................................25
II.6 Aim of this study ............................................................................................. 33

III MATERIALS AND METHODS ............................................... 34
III.1 Chemicals.........................................................................................................34
III.2 Materials and Instruments ............................................................................ 35
III.3 Buffers and Media 36
III.3.1 Buffers..................................................................................................... 36 III.3.2Media.......................................................................................................38
III.4 DNA manipulations........................................................................................40
III.4.1 General Procedures .................................................................................
III.4.2Cloning of TF-expression constructs ...................................................... 41
III.4.3 Cloning of the TF deletion mutant NC ................................................... 42
III.4.4 of the human titin I27 domain 43
III.4.5 Site-directed mutagenesis........................................................................43
III.4.6Generation of linear template DNA for in vitro translation reactions..... 44
III.5 Protein preparative methods.........................................................................45
III.5.1 Purification of TF....................................................................................
III.5.2 Purification of TEV protease .................................................................. 46
III.5.3 Isolation of ribosomes.............................................................................46
III.5.4Site-specific labeling of TF single cysteine mutants............................... 47
III.5.5 Differential labeling of TF double cysteine mutant proteins .................. 48
III.6 Protein analytical methods............................................................................49
III.6.1 Quantitation of protein concentrations....................................................
III.6.2 Quantitation of accessible thiol groups and determination of thiol reactivity... 49
III.6.3 SDS-PAGE..............................................................................................50 III.6.4Western Blotting.....................................................................................51 III.6.5 Autoradiography
III.6.6Protein production in the reconstituted system ....................................... 52
III.6.7 Limited proteolysis..................................................................................52 III.6.8Determination of FL specific activity .....................................................

iiiCONTENTS


III.7 Fluorescence Measurements.......................................................................... 54
III.7.1 General....................................................................................................54
III.7.2Equilibrium fluorescence measurements ................................................
III.7.3 Kinetic fluorescence measurements........................................................ 55
III.7.4 Competition experiments........................................................................55
III.7.5Steady state fluorescence anisotropy measurements............................... 56
III.8 Ribosome tagging............................................................................................57
III.8.1 Generation of rpl-FH-tetR cassettes 57
III.8.2Chromosomal integration of rpl-FH-tetR cassettes ................................ 58 III.8.3 P1-transduction.......................................................................................59
III.8.4Preparation of E. coli lysates for analytical ribosome isolations ............ 60
III.8.5 Sedimentation analysis of E. coli ribosomes........................................... 61
III.8.6 Ribosome pull-downs using anti-FLAG agarose.................................... 62
III.8.7 ng magnetic beads .......................................... 62
III.9 Data Evaluation and Calculations................................................................. 63
III.9.1 FRET efficiency and distance calculations ............................................. 63 III.9.2Determination of Förster distances ......................................................... 64
III.9.3 Calculation of steady state fluorescence anisotropies............................. 66
III.9.4 TF monomer-dimer