Regeneration and plastid transformation approaches in Arabidopsis thaliana and Rapid-Cycling Brassica rapa [Elektronische Ressource] / Areli Herrera Díaz. Betreuer: Hans-Ulrich Koop

Areli Herrera Díaz

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• Biologie

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2011
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Extrait

Regeneration and plastid transformation
approaches in Arabidopsis thaliana and
Rapid-Cycling Brassica rapa
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der
Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie der
Ludwig-Maximilians-Universität München

Vorgelegt von
Areli Herrera Díaz
aus Mexiko


München, 2011





















1. Gutachter: Prof. Dr. Hans-Ulrich Koop
2. Gutachter: Prof. Dr. Jörg Nickelsen
Tag der mündlichen Prüfung: 22. Juli 2011
Contents
CONTENTS
1 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................ 3
2 SUMMARY .......................... 5
3 INTRODUCTION .................. 7
3.1 Plastids ...................... 7
3.1.1 Plastid division ........................................................................ 8
3.1.2 Plastid inheritance ... 8
3.1.3 Plastid genome ...... 10
3.1.4 Plastid gene expression .......................................................... 11
3.2 Genetic transformation of plastids in higher plants ................. 12
3.2.1 Gene transfer methods and transformation vectors .................... 12
3.2.2 Selection markers .................................. 13
3.2.3 Reporter genes ...................................... 16
3.2.4 Plastid transformation in Nicotiana tabacum .............................. 16
3.2.5 Plastid transformation in different species . 18
3.3 Arabidopsis thaliana as model organism . 18
3.3.1 Tissue culture in Arabidopsis thaliana ....................................... 20
3.3.2 Protoplast culture in Arabidopsis thaliana .. 21
3.4 Rapid-Cycling Brassica rapa, a new model organism ............... 22
4 RESEARCH AIMS ................................ 24
5 MATERIALS AND METHODS ................................. 25
5.1 Chemicals and enzymes ........................................................... 25
5.2 Kits .......................................................... 27
5.3 Disposable material . 27
5.4 Equipment and instruments ..................... 27
5.5 Software and internet tools ................................ 28
5.6 Biological material ................................... 28
5.6.1 Plant material ....................................... 28
5.6.2 Medium for culture of bacteria ................. 28
5.7 Molecular methods .. 29
5.7.1 Isolation of genomic DNA of plants .......................................... 29
5.7.2 Isolation of plasmid DNA ........................ 30
5.7.3 Gel electrophoresis ................................ 30
5.7.4 DNA purification and concentration .......... 31
5.7.5 DNA quantification ................................. 31
5.7.6 DNA restriction and modification .............. 32
5.7.7 DNA ligation .......................................... 32
5.7.8 Preparation of competent cells ................................................ 33
5.7.9 Heat shock transformation of Escherichia coli ............................ 33
5.7.10 PCR and sequencing 34
5.7.11 Southern blot hybridization .................. 35
5.8 Plant tissue culture .................................................................. 38
5.8.1 Shoot induction from seeds and cotyledons in A. thaliana ........... 39
5.8.2 Protoplast isolation, embedding and culture in A............. 41

1 Contents
5.8.3 Plant tissue culture in Rapid-Cycling Brassica rapa ..................... 43
5.8.4 Plant tissue and protoplast culture in Nicotiana tabacum ............ 45
5.9 Plant transformation ............................................................... 46
5.9.1 PEG treatment of protoplasts .................. 46
5.9.2 DNA transfer using the particle gun method .............................. 47
5.10 Selection conditions ................................ 49
5.11 Microscopy .............................................. 49
6 RESULTS ......................................................... 50
6.1 Towards plastid transformation in Arabidopsis thaliana .......... 50
6.1.1 Regeneration from cotyledons in A. thaliana .............................. 50
6.1.2 Regeneration of A. thaliana from seed explants 52
6.1.3 A. thaliana protoplast culture and regeneration ......................... 56
6.1.4 Evaluation of the sensitivity of A. thaliana protoplast derived
colonies to selection agents ................................................................. 60
6.1.5 Construction of A. thaliana plastid transformation vectors ........... 61
6.1.6 Particle gun and PEG-based plastid transformation experiments in
A. thaliana ........................................................ 69
6.2 Towards plastid transformation in Rapid-Cycling B. rapa ........ 75
6.2.1 Plant regeneration from Rapid-Cycling Brassica rapa .................. 75
6.2.2 Particle gun experiments for plastid transformation in Rapid-Cycling
Brassica rapa ..................................................... 77
6.3 AmCyan as visual marker for plastid transformation in Nicotiana
tabacum ............................................................. 80
7 DISCUSSION .................... 85
7.1 Towards plastid transformation in Arabidopsis thaliana .......... 85
7.1.1 Regeneration protocols in A. thaliana ....................................... 85
7.1.2 Species specific vectors in A. ...... 89
7.1.3 Particle gun-mediated plastid transformation ............................ 93
7.1.4 PEG-mediated plastid transformation ....... 96
7.2 Towards plastid transformation in Rapid-Cycling B. rapa ........ 97
7.3 Nicotiana tabacum, a positive control in plastid transformation ..
................................................................................................ 98
7.3.1 Plastid transformation in A. thaliana and Nicotiana tabacum ...... 100
7.4 Future directions in plastid transformation of A. thaliana ...... 101
8 ABBREVIATIONS ............................................................................. 103
9 REFERENCES .................. 104
10 CURRICULUM VITAE ......... 122
11 ACKNOWLEDGEMENTS ...... 123
12 ERKLÄRUNG ................................................................................... 124



2 Zusammenfassung
1 Zusammenfassung
Plastidentransformation ist eine wertvolle Methode in der Biotechnologie,
weil sie hohe Expressionsraten rekombinanter Proteine ermöglicht und weil die
Transgene nicht durch Pollen verbreitet werden können. In der
Grundlagenforschung können die Funktion und Regulation von plastidären
Genen mit Hilfe der Plastidentransformation näher untersucht werden.
Diese Studie konzentriert sich auf die drei wichtigsten Schritte bei der
Plastidentransformation in Arabidopsis thaliana und in Rapid-Cycling Brassica rapa
(RCBr); die Etablierung eines Regenerationsprotokolls, die Konstruktion von
artspezifischen Vektoren und die Verwendung unterschiedlicher Transfor-
mationsprotokolle.
Um die Erzeugung von fertilen Pflanzen aus transformierten Zellen zu
ermöglichen, wurde zuerst ein zuverlässiges Regenerationsprotokoll etabliert.
Fertile Pflanzen von Arabidopsis thaliana wurden mit hoher Regenerationsrate aus
Kotyledonen, Kalli von Samen und Protoplasten regeneriert. In RCBr konnten
fertile Pflanzen aus Gewebekulturen von Hypokotylen regeneriert werden.
Für die Übertragung von Genen in das Genom der Plastiden wurden geeignete
Vektoren mit verschiedenen selektiven und visuellen Markern konstruiert. Diese
sorgen für eine ortsspezifische Integration der gewünschten Sequenzen und
ermöglichen die Selektion der transformierten Zelllinien. In dieser Studie wurden
artspezifische Vektoren für Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana und RCBr
konstruiert und kloniert, die Aminoglykosid-Resistenz-Marker wie das aadA-Gen
(Resistenz gegen Spectinomycin und Streptomycin), das nptII- oder das aphA6-Gen
(Resistenz gegen Kanamycin) enthielten. Um mit den Herbiziden
Phosphinothricin oder Bialaphos selektieren zu können, wurde das bar-Gen
eingeführt. Darüber hinaus wurden Fluoreszenz-Marker wie GFP, DsRed und
AmCyan als visuelle Marker hergenommen.
Nach der Etablierung eines Regenerationsprotokolls und der Konstruktion
spezifischer Vektoren wurden zwei unterschiedliche Protokolle für die
Plastidentransformation, die Particle Gun- oder die PEG (Polyethylenglykol)-

3 Zusammenfassung
vermittelte Transformationsmethode, angewandt. Allerdings konnten bisher keine
transformierten Pflanzen von Arabidopsis thaliana und RCBr erhalten werden. Dass
das Transformationsprotokoll grundsätzlich funktioniert, konnte durch die
Verwendung von Nicotiana tabacum gezeigt werden. Plastiden von Nicotiana
tabacum wurden erfolgreich mit beiden Transformationsmethoden transformiert,
und AmCyan konnte als neuer visueller Marker etabliert werden. Bei diesen
Experimenten konnten fertile, homoplasmatische Tabakpflanzen erhalten werden,
was durch Southern-Blot-Analyse und reziproke Kreuzungen bestätigt wurde.
Somit konnte die Funktionalität der verwendeten transgenen Expressions-